Giải trình tự Peptide và Protein De Novo bằng phương pháp phổ khối

Phương pháp giải trình tự peptide và protein de novo bằng phương pháp khối phổ

Giải trình tự peptide và protein de novo bằng phương pháp phổ khối (Mass Spectrometry – MS) là một kỹ thuật tiên tiến cho phép xác định trình tự axit amin của peptide hoặc protein mà không cần thông tin trình tự tham chiếu trước đó. Khác với một số phương pháp phân tích phụ thuộc vào cơ sở dữ liệu trình tự protein đã biết hoặc cơ sở dữ liệu khối phổ đã biết, giải trình tự de novo sử dụng khối phổ song song để phân tích trực tiếp dựa trên các đặc điểm phân mảnh của peptide. Do đó, trình tự peptide không có trong cơ sở dữ liệu protein, trình tự protein của loài mới và trình tự mà bộ gen chưa được giải trình tự đều có thể được phân tích. Phần mềm giải trình tự peptide và protein de novo bằng phương pháp khối phổ (mass spectrometry) là công cụ quan trọng trong nghiên cứu sinh học, đặc biệt khi không có thông tin trình tự tham chiếu. Một số phần mềm phổ biến được sử dụng để giải trình tự de novo từ dữ liệu khối phổ: PepNovo, PEAKS, pNovo…

Nguyên lý cơ bản của giải trình tự peptide và protein de novo bằng phương pháp phổ khối

Trong phép đo phổ khối, trước tiên các mẫu peptide/protein cần phân tích (đã xử lý tách, tinh sạch, phân cắt bằng enzyme) được ion hóa trước khi đi qua trường điện từ. Vì các ion có tỷ lệ khối lượng trên điện tích khác nhau chịu tác động của các lực khác nhau trong trường điện từ nên quỹ đạo chuyển động và thời gian bay của chúng, các đặc điểm có thể tách và phát hiện ion, cũng khác nhau. Trong quá trình xác định peptide bằng phép đo phổ khối song song, giải trình tự peptide de novo có thể suy ra trực tiếp trình tự peptide có khả năng xảy ra nhất từ ​​bản đồ thứ cấp. Sau khi tìm thấy một mẫu phân mảnh cụ thể, thông tin về axit amin tương ứng có thể được tính toán dựa trên sự khác biệt về khối lượng giữa các đỉnh phổ khối và sửa đổi sau dịch mã của axit amin.

Quy trình giải trình tự peptide và protein de novo bằng phương pháp phổ khối

Quy trình giải trình tự de novo protein/peptide như sau:

1. Protein được tách từ mẫu sinh học (ví dụ: tế bào, mô) bằng các phương pháp như điện di SDS-PAGE hoặc sắc ký lỏng (LC). Protein được cắt thành các peptide nhỏ hơn bằng enzyme (thường là trypsin), tạo ra các đoạn peptide để phân tích bằng phổ khối
2. Cô lập và tinh chế sản phẩm phân cắt của peptide bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao để loại bỏ các tạp chất có thể ảnh hưởng đến quá trình phân tích
3. Trước khi đưa vào nguồn ion, tách và rửa peptide bằng sắc ký lỏng cao áp
4. Ion hóa mẫu: Peptide đi qua nguồn ion và được ion hóa chuyển đổi các peptide thành các ion mang điện tích, giúp chúng có thể phân tích trong máy khối phổ. Sau khi mất nước, nó đi vào máy quang phổ khối để tạo ra phổ khối cấp một. Các phương pháp ion hóa phổ biến gồm Electrospray Ionization (ESI) và Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI).
5. Phân tách các ion: Sau khi ion hóa, các ion được đưa vào máy quang phổ để phân tách dựa trên tỷ lệ khối/lượng (m/z). Các ion này có thể được phân tách thông qua nhiều kỹ thuật như Quadrupole, Time-of-flight (TOF) hoặc Orbitrap, tùy vào loại máy phổ khối sử dụng. Một ion peptide cụ thể (ion mẹ) được chọn để phân mảnh tiếp theo.
6. Phân mảnh peptide (Fragmentation): Tùy thuộc vào các phương pháp phân mảnh được sử dụng, các loại ion mảnh khác nhau có thể được tạo ra. Các phương pháp phổ biến để phân mảnh peptide bao gồm Collision-induced dissociation (CID), Higher-Energy Collisional Dissociation (HCD) và Electron transfer dissociation (ETD). CID chủ yếu tạo ra các ion b và y; và ETD chủ yếu tạo ra các ion c và z. CID là phương pháp tiếp cận thông thường để giải trình tự các peptipe và protein trong MS/MS. Quá trình này tạo ra các ion con (fragment ions) từ ion mẹ. Các ion con được ghi nhận và tạo thành phổ MS/MS, thể hiện các mảnh peptide được tạo ra từ quá trình phân mảnh.
7. Phân tích dữ liệu: Trong đó, tỷ lệ khối lượng trên điện tích của các ion con có thể thu được bằng cách phát hiện chuyển động của ion trong trường điện từ. Trong quá trình phân tích bằng máy quang phổ khối, các ion peptide có tỷ lệ khối lượng trên điện tích cụ thể sẽ đi qua một khối lượng nhất định. Loại phân cắt bắn phá năng lượng này có thể được suy ra theo thông tin tỷ lệ khối lượng-điện tích của các ion bị phân mảnh này và các gốc axit amin peptide tương ứng có thể được suy ra từ sự sắp xếp và kết hợp, để phân giải trình tự peptide tương ứng với phổ khối. Sử dụng các thuật toán và phần mềm chuyên dụng (ví dụ: PepNovo, PEAKS, pNovoPEAKS,…) để giải trình tự các peptide dựa trên sự khác biệt về khối lượng giữa các ion fragment (b, y,…) được tạo ra trong quá trình phân mảnh. Khi các trình tự peptide được xác định, chúng sẽ được nối lại với nhau để tạo thành trình tự protein đầy đủ.

Hình 1. Sơ đồ giải trình tự peptide bằng khối phổ song song. Máy phổ khối bao gồm một nguồn ion hóa, một máy phân tích khối và một máy dò. Ban đầu, một protein quan tâm được phân cắt bằng một protease đặc hiệu, ví dụ như trypsin. Một trường điện mạnh được sử dụng để phun sương chất lỏng chứa mẫu (được cung cấp, ví dụ như bằng sắc ký lỏng) và để tích điện cho peptide, thường là bằng cách gắn proton hoặc tách proton. Quá trình này được gọi là ion hóa phun điện. Sau đó, mẫu được đưa đến máy phổ khối đầu tiên (MS-1), tại đó các peptide (P1–P3) được xác định dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) của chúng. Một peptide từ hỗn hợp peptide được chọn (P2) và sau đó phân mảnh bằng cách va chạm với một khí trơ như argon. Sự phân mảnh xảy ra chủ yếu tại các liên kết amit của peptide, tạo ra một tập hợp các peptide lồng nhau khác nhau về khối lượng của một axit amin. Máy quang phổ khối thứ hai (MS-2) phân tích tỷ lệ m/z của các mảnh peptide thu được (f1–f4). Bằng cách lắp ráp tính toán các mảnh, trình tự peptide (P2) có thể được suy ra (Tâm Trần, Research Officer, Hoan Vu Biomolecules., JSC). 

Hình 2. Quá trình giải trình tự peptide de novo bằng phương pháp phổ khối (Tâm Trần, Research Officer, Hoan Vu Biomolecules., JSC).

Ứng dụng của giải trình tự peptide và protein de novo bằng phương pháp phổ khối

• Khám phá và phân tích các protein mới: Phương pháp phổ khối de novo giúp xác định các protein hoặc các phiên bản chưa được biết đến trong các loài chưa được nghiên cứu hoặc trong các điều kiện môi trường mới. Điều này có thể hỗ trợ phát hiện các protein mới trong nghiên cứu bệnh lý, dược lý, hoặc sinh học phân tử.
• Xác định biến dị protein: Phân tích phổ khối giúp phát hiện các biến dị protein (như các đột biến, các biến thể di truyền) mà có thể không được xác định bằng các phương pháp khác. Điều này rất quan trọng trong nghiên cứu các bệnh lý di truyền và các nghiên cứu về tế bào ung thư.
• Phân tích cấu trúc protein: Phương pháp phổ khối có thể giúp nghiên cứu cấu trúc bậc ba của protein, bao gồm việc xác định các vị trí gắn kết của các phân tử nhỏ, các tương tác protein-protein hoặc sự biến đổi cấu trúc trong các điều kiện khác nhau.
• Chẩn đoán và phân tích bệnh lý: Phân tích phổ khối de novo giúp xác định các protein liên quan đến bệnh, từ đó giúp chẩn đoán và phát triển phương pháp điều trị cho các bệnh như ung thư, bệnh Alzheimer hay các bệnh lý viêm nhiễm.
• Sản xuất dược phẩm và vaccine: Phân tích peptide và protein có thể hỗ trợ việc phát triển thuốc sinh học và vaccine, thông qua việc xác định các mục tiêu protein quan trọng để phát triển các phương pháp điều trị mới.
• Phân tích các tác động của môi trường đến protein: Phương pháp này có thể giúp xác định các thay đổi trong cấu trúc và hoạt động của protein khi chúng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH hoặc các yếu tố hóa học khác.
• Nghiên cứu tương tác protein – protein (PPI): Phổ khối giúp nghiên cứu các tương tác giữa các protein, điều này rất quan trọng trong việc hiểu các con đường truyền tín hiệu tế bào, cũng như các mạng lưới protein có vai trò trong các quá trình sinh học quan trọng như sự phát triển tế bào, miễn dịch và sự phân chia tế bào.

Tài liệu tham khảo

1. Medzihradszky K F, Chalkley R J. Lessons in de novo peptide sequencing by tandem mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2013, 34(1).
2. Marshall Bern, Yuhan Cai, David Goldberg. Lookup Peaks: A Hybrid of de Novo Sequencing and Database Search for Protein Identification by Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2007, 79(4):1393-1400
3. Hao Yang, Yan Chang Li, Ming Zhi Zhao, et al. Precision De Novo Peptide Sequencing Using Mirror Proteases of Ac-LysargiNase and Trypsin for Large-scale Proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP, 2019.
4. Aebersold R, Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature, 2003,422(6928):198-207.