Lựa chọn phương pháp phân giải protein tối ưu cho proteomics: Gel hay dung dịch?

Phân giải protein là gì?

Phân giải protein, hay còn gọi là thủy phân protein, là quá trình phân cắt các protein phức tạp thành các đơn vị nhỏ hơn như peptide và axit amin. Quá trình này thường được thực hiện bằng cách sử dụng enzyme protease hoặc axit/bazơ mạnh, dưới điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp.

Tầm quan trọng của phân giải protein trong việc chuẩn bị mẫu cho khối phổ:

• Chuẩn bị mẫu cho khối phổ: Phân giải protein là một bước thiết yếu trong quá trình chuẩn bị mẫu cho khối phổ (mass spectrometry), một kỹ thuật quan trọng trong proteomics.
• Giảm độ phức tạp của mẫu: Mẫu protein tự nhiên thường rất phức tạp, chứa nhiều loại protein khác nhau. Phân giải protein giúp đơn giản hóa mẫu bằng cách chia nhỏ các protein lớn thành các peptide nhỏ hơn, dễ phân tích hơn bằng khối phổ.
• Tăng khả năng nhận diện protein: Các peptide nhỏ hơn được tạo ra từ quá trình phân giải protein dễ dàng được nhận diện và định lượng hơn bằng khối phổ so với các protein lớn.
• Phân tích cấu trúc và chức năng protein: Quá trình phân giải protein có thể giúp xác định thành phần axit amin, trình tự axit amin và các vùng chức năng của protein.

Hình 1: Tổng quan về quá trình phân giải protein và hai phương pháp phổ biến

(Dươn’gNg, Research Officer, Hoan Vu Biomolecules., JSC)

Quy trình phân giải trong gel (In-Gel Digestion)

Chuẩn bị mẫu:

• Trộn thể tích mẫu vật lý tương đương 10 µg protein với đệm mẫu Tris-Glycine SDS (Thermo Fisher Scientific).
• Đun nóng ở 60 °C trong 10 phút để biến tính protein.

Điện di SDS-PAGE: Phân tách protein theo kích thước bằng điện di gel polyacrylamide natri dodecyl sulfate (SDS-PAGE).

Nhuộm màu và tẩy màu:

• Rửa sạch gel.
• Nhuộm gel bằng thuốc nhuộm Coomassie Blue trong 30 phút.
• Tẩy màu gel bằng dung dịch methanol, axit axetic và nước, thay đổi dung dịch nhiều lần cho đến khi thuốc nhuộm dư được loại bỏ.

Phân giải gel:

• Cắt gel thành 3 phân đoạn dựa trên thang protein: 70-250 kDa, 30-60 kDa và 10-30 kDa.
• Loại bỏ dải albumin (65 kDa) nếu cần.
• Cắt nhỏ các mảnh gel để tăng diện tích bề mặt tiếp xúc.
• Rửa các mảnh gel 2-3 lần bằng 100% acetonitril (ACN) và 25 mM amoni bicarbonate (AMBIC) để loại bỏ thuốc nhuộm.
• Ủ các mảnh gel trong 10ng/µl trypsin (Thermo Fisher Scientific) qua đêm ở 37 °C để phân giải protein.

Chiết xuất peptide:

• Chiết xuất peptide đã phân giải khỏi gel bằng 2-3 lần rửa xen kẽ với 100% ACN/25 mM AMBIC.
• Thu thập dung dịch chứa peptide và bảo quản trong đá.

Làm khô và bảo quản:

• Sử dụng máy ly tâm chân không để làm khô dung dịch peptide.
• Hòa tan peptide khô trong dung dịch đệm phù hợp.
• Bảo quản mẫu peptide ở -80°C cho đến khi phân tích LC-MS/MS.

Quy trình phân giải trong Dung dịch (In-Solution Digestion)

Chuẩn bị mẫu:

• Tái huyền phù: Hòa tan protein trong dung dịch urê 8 M AMBIC 400 mM.
• Khử: Xử lý mẫu bằng DTT 50 mM ở 70°C trong 15 phút để phá vỡ liên kết disulfide.
• Alkyl hóa: Xử lý mẫu bằng IAA 100 mM trong bóng tối 20 phút ở nhiệt độ phòng để ngăn chặn sự tái hình thành liên kết disulfide.
• Pha loãng: Giảm nồng độ urê từ 8 M xuống 2 M bằng AMBIC 400 mM trong 10% ACN để tạo môi trường tối ưu cho bước phân giải.

Phân giải bằng trypsin:

• Bổ sung trypsin: Thêm trypsin cấp MS với tỷ lệ protease trên protein là 1:30 (w/w).
• Phân giải lần 1: Ủ mẫu ở 37°C trong 3 giờ.
• Phân giải lần 2: Bổ sung thêm trypsin để đạt tỷ lệ protease trên protein cuối cùng là 1:60 (w/w).
• Phân giải qua đêm: Ủ mẫu qua đêm ở 37°C.

Xử lý mẫu sau phân giải:

• Khử muối: Loại bỏ muối và các chất gây nhiễu bằng cột BondElut C18.
• Làm khô: Đông khô mẫu.

Bảo quản: Lưu trữ mẫu ở -80°C cho đến khi phân tích.

So sánh phân giải trong gel và phân giải trong dung dịch

Phương pháp phân giải	Ưu điểm	Nhược điểm
Gel	Đơn giản, dễ thực hiện: Quy trình không quá phức tạp, phù hợp với nhiều đối tượng. Loại bỏ chất gây nhiễu: Quá trình điện di giúp tách protein khỏi các chất gây nhiễu như lipid, carbohydrate, giúp cải thiện chất lượng mẫu. Phân tích protein có độ phân giải cao: Có thể phân tách protein dựa trên kích thước, giúp phân tích các protein có độ tương đồng cao.	Tốn thời gian: Quy trình thường kéo dài, đặc biệt là các bước nhuộm màu, tẩy màu và rửa gel. Mất mát protein: Có thể xảy ra mất mát protein trong quá trình cắt gel và chiết xuất peptide. Khó tự động hóa: Khó tự động hóa quy trình, đặc biệt là các bước thủ công như cắt gel.
Dung dịch	Nhanh chóng: Quy trình thường nhanh hơn so với phân giải trong gel. Hiệu suất cao: Hiệu suất phân giải protein thường cao hơn, ít bị mất mát protein. Dễ dàng tự động hóa: Có thể dễ dàng tự động hóa quy trình, giúp tăng năng suất và giảm sai sót.	Yêu cầu mẫu sạch: Mẫu protein cần được làm sạch kỹ càng để loại bỏ các chất gây nhiễu. Độ phức tạp cao: Quy trình có thể phức tạp hơn, đặc biệt là các bước khử và alkyl hóa. Khó phân tích protein có độ phân giải cao: Không thể phân tách protein dựa trên kích thước như phương pháp phân giải trong gel.

Tài liệu tham khảo

Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. (2006). In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols, 1(6), 2856–2860. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.468

Snashall, C. M., Sutton, C. W., Faro, L. L., Ceresa, C., Ploeg, R., & Shaheed, S. U. (2023). Comparison of in-gel and in-solution proteolysis in the proteome profiling of organ perfusion solutions. Clinical proteomics, 20(1), 51. https://doi.org/10.1186/s12014-023-09440-x