SRM/MRM & PRM: Phân tích protein chính xác – hiệu quả

Giới thiệu về SRM/MRM (Selected/Multiple Reaction Monitoring) & PRM (Parallel Reaction Monitoring)

Trong lĩnh vực phân tích protein, việc xác định và định lượng các protein cụ thể trong một mẫu phức tạp là một nhiệm vụ quan trọng. Để đáp ứng nhu cầu này, các phương pháp tiếp cận có mục tiêu như Giám sát Phản ứng Chọn lọc (SRM, đôi khi được gọi là Giám sát Phản ứng Đa kênh – MRM) và Giám sát Phản ứng Song song (PRM) đã ra đời. SRM/MRM và PRM cho phép phát hiện nhanh chóng, có độ lặp lại cao, độ nhạy lớn và định lượng chính xác các nhóm peptide đích đã được xác định trước. Các kỹ thuật này đóng vai trò quan trọng trong nhiều ứng dụng nghiên cứu protein, từ việc phát hiện biomarker trong chẩn đoán bệnh đến định lượng protein trong nghiên cứu dược phẩm.

Nguyên lý hoạt động của SRM/MRM và PRM

Về cơ bản, cả SRM/MRM và PRM đều dựa trên việc sử dụng máy quang phổ khối để đo lường các peptide đích. Tuy nhiên, giữa chúng có một số điểm khác biệt quan trọng.

Kỹ thuật SRM/MRM sử dụng máy quang phổ khối ba tứ cực (triple quadrupole MS) để chọn ion tiền chất, phân mảnh nó và sau đó phát hiện các ion mảnh đặc trưng. Bằng cách theo dõi các ion mảnh này, người ta có thể xác định và định lượng protein hoặc peptide mục tiêu. SRM/MRM đặc biệt phù hợp cho việc định lượng một số lượng nhỏ protein hoặc peptide đã biết trước trong một mẫu phức tạp.

PRM là một kỹ thuật tiên tiến hơn, sử dụng máy quang phổ khối có độ phân giải cao, chẳng hạn như Quadrupole-Orbitrap hoặc QqTOF, để ghi lại toàn bộ phổ phân đoạn của các peptide. Điều này cho phép phân tích toàn diện hơn về proteome, bao gồm cả việc xác định các protein mới và nghiên cứu các tương tác protein.

Hình 1. Quy trình phân tích khối phổ SRM/MRM và PRM. (Dươn’gNg, Research Officer, Hoan Vu Biomolecules., JSC)

Để hiểu rõ hơn về kỹ thuật SRM/MRM & PRM được mô tả hình 1, chúng ta sẽ đi sâu vào từng bước của quy trình này:

1. Giai đoạn tách (Seperator)

• Chuẩn bị mẫu: Mẫu được xử lý để loại bỏ các chất gây nhiễu và đưa về dạng phù hợp cho phân tích khối phổ. Quá trình này có thể bao gồm các bước như lọc, chiết tách, và làm giàu mẫu.
• Ion hóa: Mẫu được ion hóa bằng một nguồn ion hóa, chẳng hạn như nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) hoặc nguồn ion hóa hóa học (CI). Quá trình này tạo ra các ion mang điện tích dương hoặc âm.
• Tách ion: Các ion được tách dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) của chúng bằng cách sử dụng một bộ phân tích khối phổ, chẳng hạn như bộ phân tích khối phổ bốn cực (quadrupole), bộ phân tích khối phổ bẫy ion (ion trap), hoặc bộ phân tích khối phổ thời gian bay (TOF).

2. Phân tích lựa chọn ion phản ứng (SRM/MRM)

• Lọc khối phổ 1 (Mass filter 1): Bộ lọc khối phổ thứ nhất (thường là bộ lọc bốn cực) được sử dụng để chọn ion tiền chất (precursor ion- ion mẹ) dựa trên m/z của nó. Ion tiền chất là ion ban đầu được chọn để phân tích.
• Buồng va chạm (Collision cell): Ion tiền chất được đưa vào buồng va chạm, nơi nó va chạm với khí trơ (thường là argon hoặc nitơ). Va chạm này làm ion tiền chất bị phân mảnh thành các ion mảnh (fragment ion).
• Lọc khối phổ 2 (Mass filter 2): Bộ lọc khối phổ thứ hai (thường là bộ lọc bốn cực) được sử dụng để chọn một ion mảnh duy nhất dựa trên m/z của nó. Ion mảnh này được gọi là ion sản phẩm (product ion- ion con).
• Đầu dò (Detector): Ion mảnh được chọn được đưa vào đầu dò, nơi số lượng ion được đo lường. Tín hiệu từ đầu dò tỷ lệ với nồng độ của phân tử tương ứng trong mẫu.

3. Phân tích phản ứng song song (PRM)

• Lọc khối phổ 1 (Mass filter 1): Tương tự như SRM/MRM, bộ lọc khối phổ thứ nhất được sử dụng để chọn ion tiền chất dựa trên m/z của nó.
• Buồng va chạm (Collision cell): Ion tiền chất được đưa vào buồng va chạm và bị phân mảnh thành nhiều ion mảnh.
• Đầu dò (Detector): Tất cả các ion mảnh được tạo ra được đưa vào đầu dò và đo lường đồng thời.

So sánh SRM/MRM và PRM

Bảng 1: So sánh SRM/MRM và PRM

Ứng dụng của SRM/MRM & PRM trong các lĩnh vực

SRM/MRM và PRM đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu protein, bao gồm:

Phát hiện biomarker

• Khái niệm: Biomarker là các phân tử sinh học có thể được sử dụng để chẩn đoán, theo dõi bệnh tật hoặc đánh giá hiệu quả điều trị.
• Ứng dụng của SRM/MRM và PRM:
  • SRM/MRM: Được sử dụng để phát hiện và định lượng các biomarker đã biết trong mẫu sinh học (máu, nước tiểu, mô…). Ví dụ, SRM/MRM có thể được sử dụng để đo nồng độ PSA (Prostate-Specific Antigen) trong máu để chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt.
  • PRM: Cho phép phân tích đồng thời nhiều biomarker tiềm năng, giúp tìm kiếm các biomarker mới. Ví dụ, PRM có thể được sử dụng để so sánh mẫu máu của bệnh nhân ung thư và người khỏe mạnh, từ đó tìm ra các protein có nồng độ khác biệt đáng kể, có thể là biomarker tiềm năng cho ung thư.
• Ví dụ: Nghiên cứu sử dụng SRM/MRM để định lượng các protein có liên quan đến bệnh Alzheimer trong dịch não tủy, từ đó phát hiện sớm bệnh và theo dõi tiến triển của bệnh.

Nghiên cứu dược phẩm

• Vai trò của SRM/MRM và PRM:
  • SRM/MRM: Được sử dụng để đo nồng độ thuốc trong máu hoặc mô, giúp xác định dược động học của thuốc. Ví dụ, SRM/MRM có thể được sử dụng để đo nồng độ thuốc chống ung thư trong máu bệnh nhân, từ đó điều chỉnh liều lượng thuốc phù hợp.
  • PRM: Cho phép phân tích các protein bị ảnh hưởng bởi thuốc, giúp xác định tác dụng phụ của thuốc. Ví dụ, PRM có thể được sử dụng để nghiên cứu sự thay đổi protein trong gan sau khi dùng một loại thuốc mới, từ đó đánh giá độc tính của thuốc.
• Ví dụ minh họa: Nghiên cứu sử dụng PRM để so sánh mẫu tế bào ung thư trước và sau khi điều trị bằng thuốc, từ đó xác định các protein bị ảnh hưởng bởi thuốc, giúp hiểu rõ cơ chế tác dụng của thuốc.

Nghiên cứu proteome

• Khái niệm: Proteome là tập hợp tất cả các protein được biểu hiện trong một tế bào, mô hoặc cơ thể.
• Ứng dụng của PRM:
  • Phân tích toàn diện proteome: PRM cho phép phân tích toàn diện proteome, giúp hiểu rõ hơn về vai trò của protein trong các quá trình sinh học. Ví dụ, PRM có thể được sử dụng để so sánh proteome của tế bào ung thư và tế bào bình thường, từ đó tìm ra các protein có vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư.
  • Nghiên cứu tương tác protein: PRM có thể được sử dụng để nghiên cứu tương tác giữa các protein, giúp hiểu rõ hơn về các con đường tín hiệu trong tế bào. Ví dụ, PRM có thể được sử dụng để xác định các protein tương tác với một protein mục tiêu, từ đó tìm ra các protein có vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa hoạt động của protein mục tiêu.
• Ví dụ: Nghiên cứu sử dụng PRM để phân tích proteome của tế bào gan trong các điều kiện khác nhau (ví dụ: stress oxy hóa, nhiễm độc), từ đó tìm ra các protein bị ảnh hưởng bởi các điều kiện này, giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh.

Tài Liệu Tham Khảo

[1] Van Bentum, M., & Selbach, M. (2021). An Introduction to Advanced Targeted Acquisition Methods. Molecular & cellular proteomics: MCP, 20, 100165. https://doi.org/10.1016/j.mcpro.2021.100165

[2] Guerrero, L.; Paradela, A.; Corrales, F.J. Targeted Proteomics for Monitoring One-Carbon Metabolism in Liver Diseases. Metabolites 2022, 12, 779. https://doi.org/10.3390/metabo12090779

[3] Fortin, T., Salvador, A., Charrier, J. P., Lenz, C., Lacoux, X., Morla, A., Choquet-Kastylevsky, G., & Lemoine, J. (2009). Clinical quantitation of prostate-specific antigen biomarker in the low nanogram/milliliter range by conventional bore liquid chromatography-tandem mass spectrometry (multiple reaction monitoring) coupling and correlation with ELISA tests. Molecular & cellular proteomics: MCP, 8(5), 1006–1015. https://doi.org/10.1074/mcp.M800238-MCP200

[4] Awasthi, S.; Spellman, D.S.; Hatcher, N.G. Proteomic Discovery and Validation of Novel Fluid Biomarkers for Improved Patient Selection and Prediction of Clinical Outcomes in Alzheimer’s Disease Patient Cohorts. Proteomes 2022, 10, 26. https://doi.org/10.3390/proteomes10030026

[5] Wang, J., Sun, Z., Jiang, J., Wu, D., Liu, X., Xie, Z., Chen, E., Zhu, D., Ye, C., Zhang, X., Chen, W., Cao, H., & Li, L. (2017). Proteomic Signature of Acute Liver Failure: From Discovery and Verification in a Pig Model to Confirmation in Humans. Molecular & cellular proteomics: MCP, 16(7), 1188–1199. https://doi.org/10.1074/mcp.M117.067397