Phương pháp xử lý dữ liệu Proteomics
03/03/2025
Mass spectrometry-based proteomics as an emerging tool in clinical laboratories
03/03/2025
Định lượng protein bằng TMT – Tổng quan và ứng dụng
Giới thiệu
Trong nghiên cứu protein, việc xác định và định lượng sự thay đổi về mức độ biểu hiện protein giữa các mẫu là vô cùng quan trọng. Để đáp ứng nhu cầu này, kỹ thuật đánh dấu peptide bằng thẻ khối phổ song song (Tandem Mass Tags – TMT) đã được phát triển. Kỹ thuật này cho phép phân tích định lượng đồng thời và chính xác các peptide từ nhiều mẫu khác nhau.
Nguyên lý hoạt động
Kỹ thuật TMT (Tandem Mass Tags) hoạt động dựa trên nguyên tắc gắn các thẻ hóa học đẳng áp (isobaric tags) vào các peptide. Các thẻ TMT được thiết kế để có cùng khối lượng phân tử danh định, nhưng khác biệt về thành phần cấu trúc ở vùng báo cáo (reporter region). Khi các peptide đã được gắn thẻ TMT trải qua quá trình phân mảnh trong phân tích khối phổ song song (MS/MS), vùng báo cáo của thẻ TMT sẽ tách ra, tạo thành các ion báo cáo (reporter ions) với cường độ khác nhau. Cường độ của các ion báo cáo này tỷ lệ thuận với lượng peptide tương ứng trong mỗi mẫu, cho phép định lượng sự thay đổi tương đối của protein giữa các mẫu.
Hình 1. Quy trình gắn thẻ TMT vào peptide trong phân tích proteomics. (Dươn’gNg, Research Officer, Hoan Vu Biomolecules., JSC)
Cấu tạo của thẻ TMT:
Mỗi thẻ TMT là một phân tử hóa học được tạo thành từ ba phần chính:
- Nhóm báo cáo tín hiệu (Reporter group): Đây là phần quan trọng nhất, có khối lượng phân tử khác nhau giữa các thẻ TMT. Khi phân tích khối phổ kế, phần này sẽ tách ra, tạo ra các ion “báo cáo”. Cường độ của các ion này cho biết lượng peptide (và do đó là protein) trong mẫu.
- Nhóm cân bằng (Balancer group): Nhóm này có chức năng cân bằng khối lượng, đảm bảo tất cả thẻ TMT đều có tổng khối lượng như nhau, bất kể nhóm báo cáo khác biệt.
- Nhóm phản ứng (Reactive group): Phần này sẽ gắn thẻ TMT vào peptide thông qua phản ứng hóa học, thường là với nhóm amin của lysine hoặc đầu N-terminal của peptide.
Các loại thẻ TMT và ứng dụng
Hiện nay, có nhiều loại thẻ TMT khác nhau, bao gồm TMT6plex, TMT10plex, TMT11plex, TMT16plex và TMTpro, cho phép phân tích đồng thời từ 6 đến 16 mẫu. Mỗi loại thẻ TMT có cấu trúc và tính chất hóa học riêng biệt, phù hợp với các ứng dụng khác nhau. Ví dụ, TMTpro được thiết kế để có độ nhạy cao hơn và khả năng định lượng chính xác hơn so với các loại thẻ TMT truyền thống.
Bảng 1: So sánh các loại thẻ TMT phổ biến. (Dươn’gNg, Research Officer, Hoan Vu Biomolecules., JSC)
| Loại thẻ TMT | Số lượng mẫu | Ưu điểm | Nhược điểm | Ứng dụng phổ biến |
| TMT6plex | 6 | Chi phí thấp, đơn giản | Số lượng mẫu hạn chế | Phân tích so sánh đơn giản |
| TMT10plex | 10 | Số lượng mẫu vừa phải, cân bằng giữa chi phí và hiệu quả | Độ nhạy và độ chính xác trung bình | Phân tích proteome vừa phải |
| TMT11plex | 11 | Tăng số lượng mẫu so với TMT10plex | Độ nhạy và độ chính xác trung bình | Phân tích proteome vừa phải |
| TMT16plex | 16 | Số lượng mẫu lớn, tăng thông lượng | Chi phí cao, yêu cầu thiết bị và phần mềm chuyên dụng | Phân tích proteome quy mô lớn |
| TMTpro | 16+ | Độ nhạy và độ chính xác cao, phân tích mẫu phức tạp | Chi phí cao nhất, yêu cầu thiết bị và phần mềm chuyên dụng | Phân tích proteome chuyên sâu, nghiên cứu dược phẩm |
Bảng 2: So sánh TMT với các phương pháp định lượng khác. (Dươn’gNg, Research Officer, Hoan Vu Biomolecules., JSC)
| Đặc điểm | TMT (Tandem Mass Tags) | iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation) | Định lượng không gắn nhãn (Label-free quantification) |
| Nguyên lý | Gắn thẻ hóa học đẳng áp vào peptide, phân tích đồng thời nhiều mẫu trong một lần chạy MS. | Gắn thẻ hóa học đẳng áp vào peptide, phân tích đồng thời nhiều mẫu trong một lần chạy MS. | Định lượng protein dựa trên cường độ tín hiệu MS của peptide, không cần gắn thẻ hóa học. |
| Số lượng kênh | Lên đến 18 (TMTpro) | Lên đến 8 | Thường 2-3 (so sánh trực tiếp) hoặc nhiều hơn (phân tích theo lô) |
| Chi phí | Cao (thẻ TMT đắt tiền) | Trung bình (thẻ iTRAQ ít đắt hơn TMT) | Thấp (không cần mua thẻ hóa học) |
| Độ chính xác | Cao (giảm thiểu sai số do sự thay đổi trong quá trình chuẩn bị mẫu và chạy MS) | Trung bình (ít chính xác hơn TMT) | Thấp hơn (dễ bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi trong quá trình chuẩn bị mẫu và chạy MS) |
| Độ nhạy | Cao (tỷ lệ nén thấp hơn iTRAQ) | Trung bình (tỷ lệ nén cao hơn TMT) | Trung bình (không bị ảnh hưởng bởi tỷ lệ nén) |
| Độ phức tạp | Cao (yêu cầu thiết bị MS có độ phân giải cao và phân tích dữ liệu phức tạp) | Trung bình (yêu cầu thiết bị MS có độ phân giải cao và phân tích dữ liệu) | Thấp (quy trình chuẩn bị mẫu đơn giản hơn) |
| Tỷ lệ nén | Thấp (giúp tăng độ nhạy) | Cao (có thể làm giảm độ nhạy đối với các protein có mức độ biểu hiện thấp) | Không có |
| Thời gian chạy MS | Ngắn (phân tích đồng thời nhiều mẫu) | Ngắn (phân tích đồng thời nhiều mẫu) | Dài hơn (phải chạy MS cho từng mẫu riêng biệt) |
| Ứng dụng | Nghiên cứu yêu cầu độ chính xác cao, phân tích đồng thời nhiều mẫu, phân tích các mẫu phức tạp. | Nghiên cứu yêu cầu phân tích đồng thời nhiều mẫu, phân tích các mẫu có độ phức tạp trung bình. | Nghiên cứu có ngân sách hạn hẹp, quy mô nhỏ, phân tích các mẫu đơn giản. |
| Phân tích dữ liệu | Phức tạp (yêu cầu phần mềm chuyên dụng) | Phức tạp (yêu cầu phần mềm chuyên dụng) | Đơn giản hơn (có thể sử dụng nhiều phần mềm phân tích thống kê) |
Ứng dụng của TMT trong nghiên cứu và lâm sàng
Ứng dụng trong nghiên cứu ung thư:
- Mục tiêu:
- Xác định các protein liên quan đến sự phát triển, di căn và kháng thuốc của tế bào ung thư.
- Tìm kiếm các dấu ấn sinh học (biomarker) giúp chẩn đoán sớm, tiên lượng bệnh và theo dõi đáp ứng điều trị.
- Ví dụ cụ thể:
- Nghiên cứu kháng thuốc ung thư vú:
- Sử dụng TMT-SPS-MS3 để so sánh biểu hiện protein giữa các mẫu khối u vú nhạy cảm và kháng thuốc.
- Kết quả xác định các protein liên quan đến cơ chế kháng thuốc, từ đó đề xuất các mục tiêu điều trị mới.
- Nghiên cứu ung thư phổi:
- TMT được sử dụng để phân tích sự thay đổi protein trong các loại ung thư phổi khác nhau (ung thư phổi tế bào nhỏ, ung thư phổi không tế bào nhỏ).
- Tìm kiếm các dấu ấn sinh học giúp phân biệt các loại ung thư, chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh.
- Nghiên cứu kháng thuốc ung thư vú:
Ứng dụng trong nghiên cứu bệnh thần kinh:
- Mục tiêu:
- Xác định các protein liên quan đến quá trình thoái hóa thần kinh trong các bệnh như Alzheimer, Parkinson, đa xơ cứng.
- Tìm kiếm các biomarker trong dịch não tủy và các mẫu sinh học khác để chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển bệnh.
- Ví dụ cụ thể:
- Nghiên cứu bệnh Alzheimer:
- TMT được sử dụng để phân tích sự thay đổi protein trong não của bệnh nhân Alzheimer so với người khỏe mạnh.
- Kết quả xác định các protein liên quan đến sự hình thành mảng amyloid và sự thoái hóa tế bào thần kinh.
- Phân tích dịch não tủy:
- TMT giúp phát hiện các biomarker trong dịch não tủy, hỗ trợ chẩn đoán các bệnh lý thần kinh như Parkinson, đa xơ cứng và viêm màng não.
- Nghiên cứu bệnh Alzheimer:
Ứng dụng trong nghiên cứu dược phẩm:
- Mục tiêu:
- Đánh giá hiệu quả và cơ chế tác dụng của thuốc thông qua phân tích sự thay đổi biểu hiện protein trong tế bào và mô.
- Nghiên cứu độc tính của thuốc bằng cách xác định các protein bị ảnh hưởng bởi thuốc.
- Ví dụ cụ thể:
- Nghiên cứu cơ chế tác dụng của thuốc chống ung thư:
- TMT được sử dụng để phân tích sự thay đổi biểu hiện protein trong tế bào ung thư sau khi điều trị bằng thuốc.
- Kết quả giúp xác định các con đường tín hiệu bị ảnh hưởng bởi thuốc và các mục tiêu tác động của thuốc.
- Nghiên cứu độc tính của thuốc trên gan:
- TMT giúp xác định các protein bị thay đổi biểu hiện trong tế bào gan sau khi tiếp xúc với thuốc.
- Kết quả giúp đánh giá độc tính tiềm ẩn của thuốc đối với gan.
- Nghiên cứu cơ chế tác dụng của thuốc chống ung thư:
Ứng dụng trong lâm sàng:
- Mục tiêu:
- Phát hiện sớm các bệnh thông qua phân tích các dấu ấn sinh học trong mẫu máu, nước tiểu hoặc các mẫu sinh học khác.
- Theo dõi đáp ứng điều trị và điều chỉnh phác đồ điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân.
- Ví dụ cụ thể:
- Phát hiện sớm ung thư:
- TMT có thể được sử dụng để phân tích protein trong mẫu máu hoặc nước tiểu, giúp phát hiện sớm các dấu ấn sinh học của ung thư như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư buồng trứng.
- Theo dõi đáp ứng điều trị ung thư:
- TMT giúp theo dõi sự thay đổi protein trong quá trình điều trị ung thư, từ đó đánh giá hiệu quả điều trị và điều chỉnh phác đồ điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân.
- Phát hiện sớm ung thư:
Tài liệu tham khảo
Zecha, J., Satpathy, S., Kanashova, T., Avanessian, S. C., Kane, M. H., Clauser, K. R., Mertins, P., Carr, S. A., & Kuster, B. (2019). TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach. Molecular & cellular proteomics : MCP, 18(7), 1468–1478. https://doi.org/10.1074/mcp.TIR119.001385
Wang, Z., Kavdia, K., Dey, K. K., Pagala, V. R., Kodali, K., Liu, D., Lee, D. G., Sun, H., Chepyala, S. R., Cho, J. H., Niu, M., High, A. A., & Peng, J. (2020). High-throughput and Deep-proteome Profiling by 16-plex Tandem Mass Tag Labeling Coupled with Two-dimensional Chromatography and Mass Spectrometry. Journal of visualized experiments: JoVE, (162), 10.3791/61684. https://doi.org/10.3791/61684
Thompson, A., Schäfer, J., Kuhn, K., Kienle, S., Schwarz, J., Schmidt, G., Neumann, T., Johnstone, R., Mohammed, A. K., & Hamon, C. (2003). Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical chemistry, 75(8), 1895–1904. https://doi.org/10.1021/ac0262560
Thermo Fisher Scientific: Tandem Mass Tags (TMT) Mass Tagging Kits and Reagents.
Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., & Yang, F. (2015). Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics, 15(18), 3175–3192. https://doi.org/10.1002/pmic.201500108
Ong, S. E., Blagoev, B., Kratchmarova, I., Kristensen, D. B., Steen, H., Pandey, A., & Mann, M. (2002). Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP, 1(5), 376–386. https://doi.org/10.1074/mcp.m200025-mcp200
Pierce, A., Unwin, R. D., Evans, C. A., Griffiths, S., Carney, L., Zhang, L., Jaworska, E., Lee, C. F., Blinco, D., Okoniewski, M. J., Miller, C. J., Bitton, D. A., Spooncer, E., & Whetton, A. D. (2008). Eight-channel iTRAQ enables comparison of the activity of six leukemogenic tyrosine kinases. Molecular & cellular proteomics: MCP, 7(5), 853–863. https://doi.org/10.1074/mcp.M700251-MCP200
McAlister, G. C., Huttlin, E. L., Haas, W., Ting, L., Jedrychowski, M. P., Rogers, J. C., Kuhn, K., Pike, I., Grothe, R. A., Blethrow, J. D., & Gygi, S. P. (2012). Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry, 84(17), 7469–7478. https://doi.org/10.1021/ac301572t
Rozanova, S., Barkovits, K., Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H., & Marcus, K. (2021). Quantitative Mass Spectrometry-Based Proteomics: An Overview. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2228, 85–116. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1024-4_8
Hughes, C. S., Foehr, S., Garfield, D. A., Furlong, E. E., Steinmetz, L. M., & Krijgsveld, J. (2014). Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular systems biology, 10(10), 757. https://doi.org/10.15252/msb.20145625
