Mass spectrometry-based proteomics as an emerging tool in clinical laboratories

Tổng quan

• Vai trò của Proteomics:
  • Proteomics là lĩnh vực nghiên cứu tích hợp tập trung vào việc xác định và định lượng protein quy mô lớn trong mẫu sinh học.
  • Protein đóng vai trò cầu nối giữa thông tin gen và chức năng sinh học, kiểu hình bệnh tật.
  • Tương tác protein kiểm soát các con đường trao đổi chất và tín hiệu, các quá trình tế bào và hệ thống sinh vật.
• Ứng dụng lâm sàng của Proteomics dựa trên khối phổ (MS):
  • MS có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, vượt trội so với xét nghiệm miễn dịch trong phân tích nhiều loại thuốc.
  • Proteomics lâm sàng dựa trên MS cải thiện thực hành y tế ở cấp độ chẩn đoán, xác định các mục tiêu mới cho phát triển thuốc, can thiệp điều trị, tiên lượng và tìm kiếm các ứng cử viên dấu ấn sinh học.
  • FDA đã phê duyệt một số phương pháp chẩn đoán in vitro dựa trên MS để xác định mầm bệnh, sàng lọc trẻ sơ sinh, định lượng thuốc điều trị trong tuần hoàn và xét nghiệm vitamin D.
• Dấu ấn sinh học (Biomarkers):
  • Dấu ấn sinh học được chia thành dấu ấn sinh học chẩn đoán, tiên lượng và dự đoán điều trị.
  • Ví dụ:
    • Giảm biểu hiện peptide amyloid beta (Aβ) chiều dài đầy đủ và tăng protein tau trong CSF là dấu ấn sinh học đã được xác nhận lâm sàng duy nhất cho bệnh Alzheimer.
    • HNRNPA1, LTBP4, MRPS23, POLDIP2 và WBSCR16 là dấu ấn sinh học tiên lượng trong ung thư vỏ thượng thận (ACC).
    • FKBP4 và S100A9 là dấu ấn sinh học dự đoán đáp ứng hóa trị liệu tân bổ trợ ở bệnh nhân ung thư vú.
    • SHP27 dự đoán kháng doxorubicin.

Các kỹ thuật Proteomics dựa trên MS:

• Sắc ký lỏng ghép nối với MS song song (LC-MS/MS):
  • Kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất để xác định và định lượng protein toàn diện.
  • Định lượng đa hợp chính xác có thể đạt được bằng các phương pháp proteomics nhắm mục tiêu sử dụng giám sát phản ứng đa/song song/được chọn (MRM/PRM/SRM).
  • MRM sử dụng MS bộ ba tứ cực (QQQ) để phân tích các peptide proteotypic được nhắm mục tiêu xác định trước.
  • Jones et al., (2016) đã phát triển xét nghiệm MRM và định lượng 187 protein dấu ấn ứng cử viên cho ung thư đại trực tràng (CRC).
• Thu thập phụ thuộc dữ liệu (DDA) và thu thập độc lập dữ liệu (DIA):
  • DDA được sử dụng rộng rãi nhất, định lượng đạt được bằng cách kết hợp DDA với gắn nhãn đồng vị ổn định.
  • DIA, ví dụ: MS quang phổ ion mảnh lý thuyết theo cửa sổ tuần tự (SWATH-MS), cho phép phát hiện và định lượng toàn diện hầu như mọi hợp chất có thể phát hiện được trong mẫu.
  • SWATH-MS dựa trên proteomics định lượng không nhãn, có thể phát hiện 30.000–40.000 peptide trên các bộ mẫu lớn.
  • Chang et al., (2015) đã báo cáo 30 protein biểu hiện khác biệt từ phân tích SWATH không nhãn của proteome synap trong bệnh nhân Alzheimer.
  • Kim et al., (2018) đã phát triển xét nghiệm DIA nhắm mục tiêu và phát hiện đột biến dấu ấn sinh học ứng cử viên KRAS để dự đoán đáp ứng trị liệu.
• Ion mobility MS:
  • Kết hợp sự phân tách các phân tử ion hóa dựa trên khả năng di chuyển của chúng trong khí đệm mang, với khả năng phân giải độ chính xác cao của HRAM.
  • Kết hợp ion mobility bị mắc kẹt với phân mảnh nối tiếp tích lũy song song (PASEF) cho phép lựa chọn và phân mảnh nhiều tiền chất trong một lần chạy 50 ms [66, 67, 68].
  • timesTOF kết hợp time-of-flight và ion mobility bị mắc kẹt MS với sắc ký lỏng và phần mềm tự động hóa được cải thiện.

Chuẩn bị mẫu:

• Chuẩn bị mẫu là một bước quan trọng trong đặc tính proteomics của mẫu lâm sàng.
• Các dịch sinh học được phân tích phổ biến nhất bao gồm máu (huyết tương, huyết thanh) và nước tiểu, dịch tiết tuyến tiền liệt, nước bọt, nước mắt, dịch não tủy (CSF) và cổ trướng.
• Các phương pháp chuẩn bị mẫu gần đây bao gồm chuẩn bị mẫu hỗ trợ bộ lọc (FASP), MStern, bẫy huyền phù (S-trap), chuẩn bị mẫu tăng cường pha rắn (SP3) và in-StageTip (iST).

Phần mềm và phân tích dữ liệu:

• Phân tích dữ liệu sinh học lớn và phức tạp/không đồng nhất được tạo ra từ các thí nghiệm MS đòi hỏi sự phát triển của các công cụ tính toán (phần mềm và thuật toán mới).
• MaxQuant 2.0 là một nền tảng phần mềm được sử dụng rộng rãi để phân tích và giải thích dữ liệu được tạo ra từ nghiên cứu proteomics dựa trên MS.

Ứng dụng lâm sàng:

• Proteomics dựa trên MS được triển khai trong các phòng khám để hiểu sinh lý bệnh của một số bệnh.
• Các lĩnh vực ứng dụng bao gồm bệnh truyền nhiễm, xét nghiệm độ nhạy kháng khuẩn, sàng lọc độc chất nước tiểu, sàng lọc chuyển hóa trẻ sơ sinh, hồ sơ chuyển hóa lâm sàng và các tình trạng bệnh lý không lây nhiễm như ung thư và rối loạn chuyển hóa.

Quy trình khám phá dấu ấn sinh học (Biomarker discovery workflows)

• Quy trình tổng quan:
  • Nghiên cứu dấu ấn sinh học theo một chuỗi liên tục từ khám phá dấu ấn sinh học giả định, ưu tiên ứng cử viên, xác minh và xác nhận, đến ứng dụng lâm sàng và giám sát sau triển khai.
  • Giai đoạn khám phá yêu cầu xác định độ tin cậy cao và định lượng đồng thời các ứng cử viên dấu ấn sinh học, cung cấp thông tin về các protein có sự thay đổi đáng kể về mặt thống kê khi phản ứng với sự thay đổi môi trường hoặc điều trị bằng thuốc.
  • Giai đoạn khám phá tạo ra từ 100 đến 1000 ứng cử viên, và các ứng cử viên có sự khác biệt đáng kể giữa các trường hợp và đối chứng phải được ưu tiên.
  • Các phương pháp proteomics nhắm mục tiêu như các xét nghiệm đa hợp MS/MS giám sát phản ứng đa (MRM) và Tiêu chuẩn đồng vị ổn định với sự bắt giữ bởi kháng thể chống peptide (SISCAPA) có thể được sử dụng để ưu tiên các ứng cử viên dấu ấn sinh học được chọn để xác nhận.
  • Giai đoạn xác nhận sử dụng quy trình thông lượng cao với độ đặc hiệu và độ nhạy cao để xác nhận việc xác định và sàng lọc các ứng cử viên chất lượng cao hơn vào giai đoạn xác nhận tốn kém.
  • Giai đoạn xác nhận đánh giá các đặc điểm hiệu suất của dấu ấn sinh học trong thực hành lâm sàng thực tế và xác định phạm vi điều kiện mà dấu ấn sinh học sẽ cung cấp dữ liệu nghiên cứu chất lượng cao, đáng tin cậy và có thể tái tạo.
  • MS có thể đo >100 peptide với chi phí gia tăng rất nhỏ cho mỗi chất phân tích được thêm vào.
  • Một HPLC-MS/MS hoàn toàn tự động, được xác nhận lâm sàng ở chế độ MRM đã được báo cáo để xác định và định lượng các peptide amyloid β (Aβ) kiểu hoang dã và biến thể trong dịch não tủy của bệnh Alzheimer (AD).
  • Mặc dù có những tiến bộ gần đây, chỉ có một số ít dấu ấn sinh học được FDA phê duyệt trong hai thập kỷ qua, trái ngược với hơn một nghìn ứng cử viên dấu ấn sinh học được báo cáo trong tài liệu khoa học chỉ riêng cho ung thư.
  • Các rào cản bao gồm thiếu mẫu sinh học chất lượng cao, được chú thích tốt, sự không nhất quán trong đo lường và thiếu khả năng tái tạo trong và giữa các nền tảng proteomics.

Ứng dụng của proteomics lâm sàng dựa trên khối phổ (Application of mass spectrometry-based clinical proteomics)

• Proteomics so sánh trong nghiên cứu y tế (Comparative proteomics in medical research):
  • Hầu hết các nghiên cứu proteomics lâm sàng dựa vào việc xác định sự khác biệt về độ phong phú protein tương đối trong hai hoặc nhiều điều kiện một cách định lượng hoặc định tính.
  • Proteomics so sánh nhằm mục đích phân tích những thay đổi proteome khi phản ứng với sự phát triển, bệnh tật hoặc môi trường trong một quy trình hai bước bao gồm phân đoạn protein và xác định protein bằng khối phổ.
  • Máy quang phổ khối tứ cực ba được ghép nối với sắc ký lỏng thường được sử dụng để phân tích định lượng hầu hết các phân tử nhỏ để sàng lọc trẻ sơ sinh, theo dõi thuốc điều trị, vitamin D và xét nghiệm steroid.
  • MALDI kết hợp với bộ phân tích khối thời gian bay (TOF) thường được sử dụng cho vi sinh lâm sàng.
  • SRM và PRM được thực hiện trên tứ cực-Orbitrap (Q-OT) lai độ phân giải cao hoặc các thiết bị thời gian bay thường được sử dụng để định lượng protein nhắm mục tiêu trong một ma trận sinh học phức tạp.
• Bệnh học lâm sàng dựa trên khối phổ (Mass spectrometry-based clinical pathology):
  • Các xét nghiệm dựa trên khối phổ đang trở nên phổ biến hơn trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán lâm sàng và đã nổi lên như một công cụ đầy hứa hẹn cho bệnh học hiện đại [46].
  • Các tiến bộ công nghệ bao gồm hình ảnh khối phổ (MSI), các kỹ thuật in vivo mới nổi, khối phổ ion hóa phun giấy (PSI-MS) và thu nhỏ MS.
  • Các xét nghiệm dựa trên khối phổ cung cấp độ đặc hiệu và độ nhạy phân tích cao, độ chính xác chẩn đoán được cải thiện, chi phí mẫu thấp và cơ hội đa hợp.
  • MSI có thể được sử dụng để hướng dẫn cắt bỏ khối u trong phẫu thuật.
• Hình ảnh khối phổ (MSI):
  • MSI là một kỹ thuật phân tích mới nổi cho phép phát hiện và hình dung đồng thời sự phân bố không gian của các phân tử sinh học trên các mẫu mô theo cách không nhãn, không nhắm mục tiêu để phân tích đa hợp.
  • DESI và MALDI là các kỹ thuật ion hóa phổ biến nhất được sử dụng trong MSI.
  • MSI kết hợp những ưu điểm của kỹ thuật hiển vi và các phương pháp dựa trên khám phá đồng thời cho phép phân tích không gian thời gian của các mẫu sinh học phức tạp với phát hiện đa hợp.
  • MSI có thể được sử dụng trong khám phá dấu ấn sinh học, để xác định vị trí của dấu ấn sinh học trong phần mô để phân biệt giữa các mẫu ung thư và khỏe mạnh, phân loại khối u và phân giai đoạn bệnh, đánh giá ranh giới khối u từ sinh thiết cắt bỏ, cắt bỏ khối u trong phẫu thuật, định vị thuốc, các mục tiêu điều trị tiềm năng, dự đoán liệu pháp và chẩn đoán một số bệnh khác.
  • Các giao thức tối ưu hóa đã được phát triển để xác định số lượng protein bằng nhau từ cả mô đông lạnh tươi và mô FFPE.
• Các kỹ thuật in vivo mới nổi (Emerging in vivo techniques):
  • Các phương pháp dựa trên MSI hiện tại yêu cầu các bước chuẩn bị mẫu, có thời gian quay vòng tương đối cao hơn và ứng dụng hạn chế trong việc đánh giá các mẫu mô đã qua xử lý.
  • Hơn 40 kỹ thuật ion hóa xung quanh, bao gồm MS ion hóa bay hơi nhanh (REIMS), đã được mô tả trong tài liệu kể từ những thập kỷ qua.
  • REIMS đã được phát triển và tích hợp vào sử dụng lâm sàng thường quy để xác định chính xác các mô khối u trong phẫu thuật.
  • Một số phương pháp không phá hủy dựa trên REIMS đã được phát triển với độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phân tích và xác định các mẫu mô in vivo và ex vivo mà không cần chuẩn bị mẫu và trong thời gian thực.

Proteomics dựa trên khối phổ trong chẩn đoán bệnh (Mass spectrometry-based proteomics in diseases diagnosis):

• • Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm (Diagnosis of infectious diseases):
    • Các công nghệ dựa trên MS và proteomics ngày càng được sử dụng để mô tả các chi tiết phân tử của tương tác vật chủ mầm bệnh và cung cấp thông tin chi tiết về cơ sở sinh học của bệnh truyền nhiễm.
    • Proteomics lâm sàng dựa trên MS đã được sử dụng để xác định nhanh chóng và phân loại các mầm bệnh virus, vi khuẩn và nấm.
    • Sự phát triển của MALDI-TOF cho phép xác định vi khuẩn nhanh chóng và phân loại chủng, nghiên cứu dịch tễ học, phát hiện tác nhân chiến tranh sinh học, phát hiện mầm bệnh lây truyền qua nước và thực phẩm, và phát hiện kháng kháng sinh.
    • MALDI Biotyper CA System có thể xác định 210 loài hoặc nhóm loài, bao gồm thư viện 280 loài vi khuẩn và nấm men quan trọng trên lâm sàng, và đại diện cho hơn 98% quy trình xác định vi khuẩn điển hình của phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng.

Chẩn đoán nhiễm khuẩn (Diagnosis of Bacterial Infections)

• Nhận dạng vi sinh vật (Microbial identification): Quá trình xác định các vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn, gây bệnh.
• Phương pháp dựa trên MS (MS-based methods): Các phương pháp phân tích sử dụng khối phổ (Mass Spectrometry) để nhận dạng vi sinh vật dựa trên chuỗi peptide đặc trưng.
  • MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry): Một kỹ thuật MS nhanh chóng và hiệu quả để xác định vi sinh vật dựa trên “dấu vân tay” protein.
  • LC-MS/MS (Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry): Một kỹ thuật MS mạnh mẽ hơn, kết hợp sắc ký lỏng và khối phổ song song, được sử dụng trong nhiều ứng dụng chẩn đoán.
• Kháng kháng sinh (Antimicrobial resistance): Khả năng của vi khuẩn chống lại tác dụng của thuốc kháng sinh.
• Kiểu gen chủng (Strain typing): Xác định các biến thể khác nhau của cùng một loài vi khuẩn.
• Chẩn đoán huyết thanh (Serodiagnostic antigens): Các kháng nguyên được sử dụng để phát hiện kháng thể trong huyết thanh, chỉ ra sự hiện diện của nhiễm trùng.

Chẩn đoán nhiễm virus (Diagnosis of Viral Infections)

• Nhận dạng và phân loại virus (Viral identification and genotyping/subtyping): Xác định loại virus và các biến thể di truyền của nó.
• Biomarker protein (Protein biomarkers): Các protein được sử dụng để chỉ ra sự hiện diện hoặc tiến triển của nhiễm virus.
• Xét nghiệm Cov²MS (Cov²MS assay): Một xét nghiệm MS được phát triển để chẩn đoán SARS-CoV-2.
• Kháng thuốc kháng virus (Drug resistance against antivirals): Khả năng của virus chống lại tác dụng của thuốc kháng virus.

Chẩn đoán nhiễm nấm (Diagnosis of Fungal Infections)

• Nhận dạng nấm (Fungal identification): Xác định các loài nấm gây bệnh.
• Kiểu gen chủng nấm (Fungal strain typing): Xác định các biến thể khác nhau của cùng một loài nấm.
• Kháng thuốc kháng nấm (Antifungal drug susceptibility): Xác định khả năng của nấm chống lại thuốc kháng nấm.
• Biomarker chẩn đoán (Diagnostic biomarkers): Các phân tử được sử dụng để chỉ ra sự hiện diện của nhiễm nấm.

Khối phổ proteomics trong chẩn đoán ung thư (Mass spectrometry-based proteomics in cancer diagnosis)

• Proteomics: Nghiên cứu toàn bộ protein trong một tế bào hoặc sinh vật.
• Biomarker ung thư (Cancer biomarker): Một phân tử sinh học (protein) được tìm thấy trong máu, dịch cơ thể hoặc mô, cho thấy một quá trình sinh lý bình thường hoặc bất thường, hoặc trạng thái bệnh ung thư.
• Phân tích proteogenomic (Proteogenomic analysis): Nghiên cứu tích hợp bộ gen và protein để hiểu cơ sở phân tử của các loại ung thư khác nhau.
• LC/MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry): Một kỹ thuật được sử dụng để phát hiện các biomarker liên quan đến ung thư.
• Kháng thuốc (Treatment resistance): Khả năng của tế bào ung thư chống lại tác dụng của thuốc điều trị.
• Chẩn đoán sớm (Early detection): Phát hiện ung thư ở giai đoạn đầu.
• Tiên lượng (Prognosis): Dự đoán sự tiến triển của bệnh ung thư.
• Liệu pháp nhắm mục tiêu (Molecular targeted therapies): Các phương pháp điều trị nhắm mục tiêu các phân tử cụ thể liên quan đến sự phát triển của ung thư.
• Xét nghiệm dựa trên bảng nhiều dấu ấn sinh học (panels of multiple biomarkers): Xét nghiệm sử dụng nhiều dấu ấn sinh học để tăng độ chính xác chẩn đoán.

Khối phổ kế (MS) và Proteomics:

• Nguyên lý hoạt động của MS:
  • MS hoạt động bằng cách ion hóa các phân tử, sau đó tách chúng dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z).
  • Các ion được phát hiện và kết quả được hiển thị dưới dạng phổ khối lượng, cung cấp thông tin về thành phần và cấu trúc của các phân tử.
  • Trong proteomics, MS được sử dụng để xác định và định lượng protein trong các mẫu sinh học.
• Ứng dụng của Proteomics dựa trên MS:
  • Xác định Biomarker: Tìm kiếm các protein có sự thay đổi về mức độ biểu hiện hoặc cấu trúc trong các bệnh lý.
  • Phân tích cấu trúc protein: Nghiên cứu các biến đổi sau dịch mã, tương tác protein-protein và các đặc điểm cấu trúc khác.
  • Phát triển thuốc: Xác định các mục tiêu thuốc và theo dõi phản ứng của protein với các phương pháp điều trị.
  • Chẩn đoán bệnh: Phát hiện sớm các bệnh thông qua việc phân tích các protein liên quan đến bệnh.

Rối loạn chuyển hóa di truyền và ứng dụng của MS:

• Rối loạn chuyển hóa di truyền:
  • Là các bệnh do đột biến gen gây ra, dẫn đến thiếu hụt enzyme và rối loạn các quá trình chuyển hóa.
  • Các bệnh này có thể ảnh hưởng đến chuyển hóa axit amin, carbohydrate, lipid và các chất khác.
• Ứng dụng của MS trong chẩn đoán rối loạn chuyển hóa di truyền:
  • Sàng lọc sơ sinh: MS được sử dụng để sàng lọc đồng thời nhiều rối loạn chuyển hóa trong mẫu máu của trẻ sơ sinh.
  • Chẩn đoán xác định: MS giúp xác định chính xác các rối loạn chuyển hóa bằng cách phân tích các chất chuyển hóa và protein liên quan.
  • Theo dõi điều trị: MS được sử dụng để theo dõi hiệu quả của các phương pháp điều trị và điều chỉnh liều lượng thuốc.
• Các kỹ thuật MS phổ biến trong chẩn đoán:
  • LC-MS/MS: Kết hợp sắc ký lỏng để tách các chất chuyển hóa và protein, sau đó phân tích bằng MS/MS để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu.
  • SWATH-MS: Một kỹ thuật MS định lượng giúp phân tích đồng thời nhiều protein trong các mẫu phức tạp.
  • MSI (Mass Spectrometry Imaging): Kỹ thuật hình ảnh khối phổ cho phép phân tích sự phân bố không gian của các phân tử sinh học trong các mẫu mô.

Các yếu tố cần xem xét khi triển khai MS trong lâm sàng:

• Chi phí đầu tư: Thiết bị MS và các thiết bị phụ trợ có chi phí đầu tư ban đầu cao.
• Nhân lực chuyên môn: Cần có nhân viên được đào tạo chuyên sâu về MS và phân tích dữ liệu.
• Tiêu chuẩn hóa quy trình: Cần có các quy trình chuẩn hóa để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.
• Phân tích và lưu trữ dữ liệu: Cần có hệ thống phân tích và lưu trữ dữ liệu hiệu quả để xử lý lượng dữ liệu lớn từ MS.
• Tự động hóa: Tự động hóa các quy trình MS để tăng hiệu suất và giảm thiểu sai sót.

Triển vọng tương lai:

• Sự phát triển của các hệ thống MS nhỏ gọn và dễ sử dụng sẽ giúp mở rộng ứng dụng của MS trong các phòng khám và điểm chăm sóc bệnh nhân.
• Việc tích hợp trí tuệ nhân tạo và học máy vào phân tích dữ liệu MS sẽ giúp tăng tốc độ và độ chính xác của chẩn đoán.
• MS sẽ đóng vai trò ngày càng quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị cá nhân hóa dựa trên đặc điểm phân tử của từng bệnh nhân.