Applications of Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) in Protein Analysis for Biomedical Research
05/03/2025
Cách mạng hóa Proteomics: Tiến bộ trong công nghệ, tích hợp AI và ứng dụng rộng hơn
11/03/2025
Phản ứng phân hủy Edman
Phản ứng phân hủy Edman là phương pháp giải trình tự protein được Pehr Edman công bố vào năm 1950. Phương pháp này giúp xác định được trình tự mở rộng của peptide hoặc toàn bộ protein bằng cách thực hiện theo một loạt các bước và loại bỏ các axit amin đầu N theo cách tuần tự khỏi một peptit hoặc protein. Đây là một công cụ mạnh mẽ cho các nghiên cứu về proteomics1.
Sự phân hủy Edman là một quy trình ba bước bao gồm:
- Ghép phenyl isothiocyanate (PITC) với nhóm α-amino của một peptit hoặc protein,
- Cắt axit amin đầu amino (thông qua quá trình tạo vòng trong axit per-fluorinated mạnh, thường là axit trifluoroacetic (TFA), thành 2-anilino-5-thiazolinone)
- Chuyển đổi thiazolinone thu được trong axit nước thành đồng phân ổn định hơn của nó, axit amin phenylthiohydantion (PTH).
Quy trình thực hiện phản ứng phân huỷ Edman
Bắt đầu bằng việc loại bỏ và xác định các gốc axit amin ở cuối chuỗi peptide, tức là các gốc có nhóm α-amino tự do, thông qua một loạt các phản ứng hóa học. Đồng thời, gốc tiếp theo trong chuỗi được tạo ra và trải qua cùng một vòng phản ứng hóa học. Lặp lại quá trình này sẽ tiết lộ trình tự của chuỗi polypeptide. Một trong những thuốc thử quan trọng nhất trong phân tích trình tự là phenyl isothiocyanate, được phát triển bởi Edman. Hơn nữa, thuốc thử này phản ứng với phần còn lại của đầu N của cả peptide và protein1, 2.
Hình 1 – Cấu trúc phân tử phenyl isothiocyanate (PITC)
Để giảm thiểu sự thủy phân axit tại mỗi vị trí của chuỗi polypeptide, cần tạo ra môi trường khan càng nhiều càng tốt. Sau phản ứng với phenyl isothiocyanate, mẫu protein được ủ với axit khan (ví dụ, axit trifluoroacetic (TFA)) phá vỡ liên kết peptide giữa axit amin thứ nhất và thứ hai của protein. Việc giảm thiểu sự cắt axit này có thể dẫn đến trình tự bền hơn và rõ ràng hơn. Khi có mặt một axit mạnh, liên kết peptit đầu tiên bị cắt, tạo thành một đoạn peptit mất bazơ đầu tiên và giải phóng phần dư thứ nhất dưới dạng anilinothiazolinone (ATZ). Rửa sạch các chất phản ứng khác và phần dư được giải phóng, đoạn peptit ngắn hơn có thể giải phóng phần dư thứ hai bằng một vòng phản ứng ghép nối và phản ứng cắt khác, cứ tiếp tục như vậy cho đến khi phần dư amino acid cuối cùng được giải phóng1, 2.
Một số cặn amino acid đã biến đổi (ví dụ, nhóm asparagine glycosyl hóa) có thể hòa tan kém trong dung môi hữu cơ và do đó xuất hiện dạng trống tại các điểm tương ứng trong trình tự của chúng. Trong giải trình tự pha rắn, có thể thử các phương pháp khác để chiết xuất cặn ATZ bằng cách chiết xuất với dung môi hữu cơ (ethyl acetate hoặc chlorobutane), khi peptide được liên kết cộng hóa trị với chất mang rắn. Tuy nhiên, lưu ý rằng các peptide còn lại không thể được chiết xuất hoặc bị mất (dẫn đến sản lượng giảm mạnh). Sự ghép nối diễn ra nhanh nhất và hoàn toàn nhất trong điều kiện kiềm ở độ pH trên pK của nhóm amino (pH = 7,8), tại đó nó không tích điện, và ở độ pH dưới 10, trên đó PITC bị thủy phân1, 2.
Các axit amin ở phần còn lại của đầu N trở nên tự do dưới dạng dẫn xuất thiazolinone. Sau đó, thiazolinone này được chiết xuất bằng dung môi hữu cơ và sấy khô. Cuối cùng, nó được chuyển thành dẫn xuất PTH ổn định hơn. Các dẫn xuất PTH từ mỗi chu kỳ phân hủy Edman được tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đảo ngược (RP-HPLC) hoặc phương pháp sắc ký lỏng (LC). Các dư lượng axit amin PTH từ mỗi chu kỳ được xác định và định lượng tuần tự bằng cách so sánh với các tiêu chuẩn, và các trình tự được mô tả theo thứ tự từ đầu N đến đầu C1, 2.
Ưu điểm của phản ứng phân huỷ Edman
Một lợi thế hữu ích của phương pháp này là có thể phân tích đồng thời bốn đến sáu peptide, mỗi chu kỳ phân hủy mất khoảng 1 giờ. Kỹ thuật giải trình tự mẫu nhiều này đặc biệt hữu ích để sàng lọc hồ sơ rửa giải sắc ký của hỗn hợp peptide liên quan đến năng suất định lượng và trình tự đầu N của chúng.
Nhược điểm của phản ứng phân huỷ Edman
Mặc dù phương pháp Edman tự động nhanh hơn phương pháp Sanger, nhưng nó chậm hơn và khó hơn các phương pháp giải trình tự DNA khác. Vì protein được tạo thành từ các chuỗi polypeptide liên kết với nhau bằng các tương tác không cộng hóa trị và cầu nối disulfide, nên bước đầu tiên là tách các cấu trúc polypeptide này ra và biến chúng thành một chuỗi polypeptide riêng biệt. Một số hóa chất biến tính (ví dụ như urea và guanidine hydrochloride) được sử dụng cho mục đích đó. Một số hợp chất oxy hóa và khử phá vỡ các liên kết disulfide; sau đó các chuỗi polypeptide được tách ra bằng sắc ký.
Kỹ thuật Edman đặc biệt ảnh hưởng đến protein ở đầu N của chúng. Theo đó, nếu protein này được biến đổi về mặt hóa học hoặc đã lưu trữ các protein này trong trường hợp của các peptide lớn, kỹ thuật này không hoạt động như yêu cầu để có được đầu ra đáng tin cậy. Mặc dù lợi thế chính của kỹ thuật Edman là dễ tiếp cận hơn trong nhiều phòng thí nghiệm và do đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định trình tự protein và cũng cải thiện tỷ lệ nhận dạng trong phương pháp sắc ký khí và sắc ký lớp mỏng mới phát triển gần đây, vẫn khó có thể thực hiện xác định đáng tin cậy tất cả các axit amin trong một bước. Do đó, để có kết quả rõ ràng, có thể cần một quy trình riêng biệt để xác định vị trí của cầu nối disulfide và nồng độ peptide lớn hơn 1 pM.
Tài liệu tham khảo
1. T. Nakajima, K. Imai, and H. Watanabe, A NEW STRATEGY AND TACTICS FOR PROTEIN SEQUENCING, in Recent Progress of Life Science Technology in Japan, Y. Ikawa and A. Wada, Editors. 1989, Academic Press. p. 235-242.
2. K. Z. Masoodi, S. M. Lone, and R. S. Rasool, Chapter 16 – Dansyl-Edman method of peptide sequencing, in Advanced Methods in Molecular Biology and Biotechnology, K.Z. Masoodi, S.M. Lone, and R.S. Rasool, Editors. 2021, Academic Press. p. 89-92.
Uyen Nguyen (Research Officer, Hoan Vu Biomolecules., JSC.)
BÀI VIẾT MỚI >>
- Các phương pháp phân tích định lượng, định tính
Các phương pháp phân tích định lượng, định tính Giá trên đã bao gồm thuế phí. - Các phương pháp phân tích Sinh Hóa Lý
- Tổng quan về ELISA
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) là kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng enzyme để phát hiện và định lượng kháng nguyên hoặc kháng thể. Có […] - Các phương pháp chiết tách protein trong nghiên cứu proteomics và ứng dụng
Các tiến bộ trong công nghệ proteomics không thể khắc phục được các vấn đề trong chuẩn bị mẫu. Các bước như đồng nhất hóa mô, […] - Sự hình thành cầu disulfide trong protein
Tầm quan trọng của cầu nối Disulfide Ổn định cấu trúc Protein: Cầu nối disulfide giúp ổn định cấu trúc bậc ba và bậc bốn của […] - TỔNG QUAN WESTERN BLOTTING
Western Blotting (WB) là kĩ thuật phân tích protein được sử dụng rộng rãi trong ngành sinh hoá, sinh học phân tử. Là một kĩ thuật […] - Palmitoyl và khử palmitoyl: Vai trò trong sinh học tế bào và ung thư
Palmitoyl hóa là quá trình gắn nhóm palmitate vào protein, giúp điều chỉnh vị trí và chức năng của chúng. Quá trình này có thể đảo […] - Phân tích trình tự kháng thể: Khám phá sự đa dạng và ứng dụng
Cấu trúc kháng thể Kháng thể, còn được gọi là immunoglobulin, là một cấu trúc hình chữ Y bao gồm bốn chuỗi polypeptide – hai chuỗi […] - Giải trình tự peptide: Công cụ cốt lõi trong nghiên cứu Proteomics
Giải trình tự peptide là quá trình xác định trình tự các axit amin trong một chuỗi peptide. Đây là kỹ thuật then chốt trong proteomics, […] - Phân tích axit amin trong dinh dưỡng và công nghiệp thực phẩm
Axit amin đóng vai trò then chốt trong việc làm sáng tỏ mối quan hệ phức tạp giữa dinh dưỡng và ngành công nghiệp thực phẩm. […]
