Palmitoyl và khử palmitoyl: Vai trò trong sinh học tế bào và ung thư
24/03/2025
Sự hình thành cầu disulfide trong protein
10/04/2025
TỔNG QUAN WESTERN BLOTTING
Western Blotting (WB) là kĩ thuật phân tích protein được sử dụng rộng rãi trong ngành sinh hoá, sinh học phân tử. Là một kĩ thuật được phát triển từ DNA (Southern) Blotting, RNA (Nothern) Blotting, WB tận dụng khả năng phân tách protein từ SDS-PAGE và khả năng tương tác giữa các kháng thể, kháng nguyên để định tính và bán định lượng protein trong hỗn hợp mẫu.
WB là kĩ thuật được phát triển sau khi điện di SDS-PAGE. Trong đó, SDS-PAGE sẽ tách hỗn hợp mẫu thành các band protein với kích thước phân tử tương ứng. Sau điện di, gel sẽ được chuyển sang màng và ủ với các kháng thể sơ cấp, thứ cấp để kiểm tra khả năng tương tác của mẫu với các kháng thể.
Quy trình tổng quát
Hình 1. Sơ đồ quy trình tổng quát của WB
(Duc Phuc Tran, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)
Điện di SDS-PAGE
- Điện di trên polyacrylamide gel biến tính với sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) là một kỹ thuật điện di protein phổ biến trong sinh hóa và sinh học phân tử. Kỹ thuật này tận dụng khả năng biến tính, tích điện âm đồng đều lên các protein của SDS, biến chúng từ cấu trúc phức tạp trở nên đơn giản, phù hợp với khả năng điện di.
- Sau khi xử lý protein với SDS, mẫu được điện di với môi trường polyacrylamide gel có cấu trúc mạng lưới với các lỗ. Khả năng di chuyển của protein phụ thuộc vào kích thước phân tử của chúng, kích thước càng lớn thì di chuyển càng chậm.
- SDS-PAGE là bước đệm cần thiết để thực hiện WB. Hai kĩ thuật này bổ trợ lẫn nhau, SDS-PAGE phân tách protein tạo điều kiện cho WB phát hiện mục tiêu, WB tận dụng kết quả của SDS-PAGE để phân tích rõ hơn về khả năng biểu hiện của protein.
Chuyển protein từ gel sang màng (Blotting)
- Sau khi phân tách kích thước protein với SDS-PAGE, protein sẽ được chuyển từ gel lên màng nitrocellulose hoặc PVDF qua quá trình Blotting. Blotting có vai trò quan trọng trong WB, quá trình này giúp protein cố định tại vị trí tương ứng với gel, tạo điều kiện cho các kháng thể tương tác với mẫu.
- Khi thực hiện Blotting, có 2 loại màng thường được sử dụng: màng nitrocellulose, màng polyvinylidene difluoride (PVDF). Tuỳ thuộc vào điều kiện và mục đích sử dụng có thể sử dụng một trong hai loại màng này.
Bảng 1. So sánh màng nitrocellulose và màng PVDF (Duc Phuc Tran, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)
| Loại màng | Ưu điểm | Nhược điểm |
| Màng nitrocellulose | – Giá thành thấp – Thao tác đơn giản | – Độ bền kém – Khả năng cố định protein thấp – Không có khả năng tái sử dụng |
| Màng PVDF | – Độ bền cao – Khả năng cố định protien cao – Có khả năng tái sử dụng | – Giá thành cao – Cần hoạt hoá trước khi dùng |
- Sau khi lựa chọn được màng sử dụng, bước tiếp theo là thực hiện blotting. Có nhiều phương pháp để thực hiện: khuếch tán, chuyển màng chân không (vacuum blotting), electroblotting.
a) Khuếch tán:
- Khuếch tán ban đầu được sử dụng chuyển protein từ gel mỏng sang màng. Trong quy trình này, một tấm màng sẽ được đặt lên trên gel, sau đó đặt giấy lọc trên màng. Đặt một cốc thuỷ tinh và một vật có khối lượng xác định lên toàn bộ để tạo điều kiện cho protein khuếch tán từ gel sang màng. Đây là phương pháp đơn giản tuy nhiên phương pháp này không được chấp nhận, tin dùng vì nó không đảm bảo chất lượng, số lượng protein được khuếch tán sang màng.
b) Chuyển màng chân không (Vacuum blotting)
- Để khắc phục tình trạng chất lượng protein khuếch tán không được đảm bảo, Vacuum blotting đã được phát triển và sử dụng. Trong phương pháp này, giấy lọc khô được đặt trên màng polytethylene có các lỗ. Ngâm màng chuyển (nitrocellulose hoặc PVDF) trong blotting buffer, sau đó đặt trên giấy lọc khô. Phía trên màng chuyển là SDS-PAGE gel, trên gel là các tấm giấy lọc đã ngâm blotting buffer. Và đặt 2 tấm nhựa bọc 2 bên rìa của gel với lớp giấy lọc. Sau khi hoàn thành, bọc cả hệ thống với cao su hoặc tấm nhựa và đưa vào hệ thống hút chân không, khi hút, blotting buffer sẽ di chuyển xuống gel.
Hình 2. Hệ thống Vacuum blotting
(Duc Phuc Tran, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC).
c) Electroblotting
- Electroblotting là phương pháp chuyển màng được ưa chuộng nhất. Trong phương pháp này, SDS-PAGE gel, màng sẽ được ép với giấy lọc, miếng đệm ở cả hai mặt tạo hệ thống Sandwich. Sau khi tạo “sandwich”, có 2 cách để hoàn tất electroblotting:
- Wet transfer: ngâm hệ thống Sandwich vào môi trường blotting buffer trong điện trường âm, protein sẽ di chuyển theo điện trường từ gel sang màng. Đây là phương pháp thường được sử dụng cho WB.
- Semi-dry transfer: hệ thống Sandwich được đặt giữa giấy thấm đã được với blotting buffer
Hình 3. Hệ thống Sandwich chuẩn bị cho Electroblotting
(Duc Phuc Tran, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC).
Bảng 2. So sánh các phương pháp blotting (Duc Phuc Tran, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)
| Phương pháp | Ưu điểm | Nhược điểm |
| Khuếch tán | – Thao tác đơn giản – Giá thành thấp – Không dùng blotting buffer | – Khả năng cố định kém – Mất nhiều thời gian – Khả năng kiểm soát kém |
| Vacuum blotting | – Nhanh chóng – Thao tác đơn giản – Ít sử dụng dung blotting buffer | – Có thể biến tính protein – Có thể không hiệu quả với protein kích thước lớn |
| Electroblotting | – Hiệu quả với protein kích thước lớn và nhỏ – Khả năng cố định cao – Khả năng kiểm soát cao | – Mất nhiều thời gian hơn Vacuum blotting – Cần dùng blotting buffer |
Blocking
- Trước khi ủ màng với các kháng thể, để tránh sự tương tác không đặc hiệu của màng chuyển với các kháng thể tại vị trí không mong muốn, ta cần ủ màng với blocking solution. Màng chuyển sẽ được rửa với dung dịch đệm TBST (Tris-Buffered Saline with Tween 20). Sau đó, ủ với blocking solution, một dung dịch có khả năng ngăn phản ứng với các vị trí không không mong muốn trên màng, ngăn không cho kháng thể gắn đặc hiệu vào các vị trí này, từ đó các kháng thể chỉ tương tác với protein mẫu.
Hình 4. Cơ chế hoạt động của Blocking solution
(Duc Phuc Tran, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC).
- Blocking solution sử dụng trong WB có thể chia thành 2 loại: protein-based blockers và non-protein blockers, tuỳ vào loại mẫu và mục đích của thí nghiệm mà sử dụng các loại blocking solution khác nhau:
- Protein-based blockers: là dung dịch với thành phần chính là protein. Blocking solution được ưa dùng nhất trong loại này là NFDM (sữa bột tách béo), với thành phần chính là casein. Với ưu điểm giá thành thấp và hiệu quả với đa số các loại protein, NFDM được sử dụng phổ biến trong WB. Tuy nhiên casein là phosphoprotein nên khi sử dụng NFDM với các loại protein phosphoryl hoá có thể tạo hiệu ứng nền. Để tránh tình trạng này, NFDM sẽ được thay thế bằng Bovine serum albumin (BSA).
- Non-protein blocker: thành phần chính của blocking solution dạng này thường là các polymer tổng hợp như PVP. Dung dịch này sẽ tạo màng ưa nước trên màng chuyển, từ đó giảm hiệu ứng nền, ngăn sự tương tác vào vị trí không mong muốn của các protein.
- Sau khi hoàn tất ủ màng với blocking solution, màng được rửa với TBST để loại bỏ các tạp chất, các protein không phản ứng khỏi màng, chuẩn bị cho quá trình ủ với các kháng thể.
Ủ với kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp
- Sau khi rửa màng với TBST, màng chuyển được lần lượt ủ với các kháng thể sơ cấp (primary antibody) và kháng thể thứ cấp (secondary antibody). Đây là bước quan trọng của cả quá trình thực hiện WB, sử dụng cơ chế tương tác đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên để phát hiện mục tiêu, trong đó kháng thể sơ cấp sẽ phát hiện mục tiêu, kháng thể thứ cấp sẽ gắn với kháng thể sơ cấp đã gắn và tạo tín hiệu:
- Kháng thể sơ cấp: là kháng thể đặc hiệu với protein mục tiêu, được tạo ra để nhận diện và liên kết với kháng nguyên mục tiêu. Sự liên kết giữa kháng thể sơ cấp và kháng nguyên mục tiêu là tiền đề quan trọng cho việc phát tín hiệu của kháng thể thứ cấp. Vì đây là thành phần quan trọng, một kháng thể sơ cấp cần đáp ứng độ đặc hiệu cao, tức nó chỉ được liên kết với kháng nguyên mục tiêu và không liên kết với bất kì protein nào khác.
- Kháng thể thứ cấp: là kháng thể đặc hiệu với kháng thể sơ cấp đã dùng. Ngoài ra, kháng thể này mang theo một chất phát tín hiệu (thường là Horseradish Peroxidase – HRP). Kháng thể này chỉ đặc hiệu duy nhất với kháng thể sơ cấp, nó không đặc hiệu với kháng nguyên mục tiêu. Khi kháng thể này tương tác với kháng thể sơ cấp, sẽ hình thành phức hợp protein-kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp. Sau khi ủ cả 2 loại kháng thể, một cơ chất được bổ sung để các phức hợp này phát tín hiệu, cơ chất này chỉ phản ứng với chất phát tín hiệu (được kháng thể thứ cấp mang theo) tại nơi có phức hợp, từ đó phát tín hiệu chính xác.
Phát hiện protein đích và ghi nhận kết quả
- Chất phát tín hiệu: tuỳ thuộc vào bản chất, chất phát tín hiệu được chia thành 3 loại chính: hoá phát quang, huỳnh quang, phản ứng chỉ thị màu.
- Hoá phát quang (chemiluminescence): Phương pháp này tận dụng các phản ứng hoá học tạo ra ánh sáng, tiêu biểu là phản ứng giữa enzyme Horseradish Peroxidase (HRP) với cơ chất luminol hoặc ECL (enhanced chemiluminescence). Chỉ khi kháng thể thứ cấp mang enzyme HRP gắn đặc hiệu với kháng thể sơ cấp mới có phản ứng hoá phát quang này, sau khi phản ứng hoàn tất, mẫu sẽ được chụp và đo tín hiệu phát quang, từ đó phát hiện khả năng tương tác giữa các protein. Phương pháp này có độ đặc hiệu cao, tín hiệu ổn định vì vậy đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất.
- Huỳnh quang (fluorescence): phương pháp này sử dụng kháng thể thứ cấp mang theo chất phát huỳnh quang, vì vậy phương pháp này không cần bổ sung cơ chất để thu nhận tín hiệu. Khi kháng thể thứ cấp gắn đặc hiệu với kháng thể sơ cấp, chất phát tín hiệu sẽ tạo huỳnh quang, từ đó ta có thể đọc kết quả dễ dàng với máy đọc tín hiệu huỳnh quang. Phương pháp này có độ nhạy rất cao, tín hiệu ổn định và có khả năng đọc nhiều tín hiệu. Tuy nhiên sử dụng chất phát huỳnh quang cần có thiết bị chuyên dụng.
- Phản ứng chỉ thị màu: Alkaline phosphatase được kháng thể thứ cấp mang theo, nếu kháng thể thứ cấp được gắn đặc hiệu với kháng thể sơ cấp và có mặt các cơ chất phù hợp sẽ tạo nhóm indoxyl phosphate. Sau đó, mẫu sẽ được bổ sung muối tetrazolium. Nhóm indoxyl phosphate sẽ khử tetrazolium thành diformazan với màu xanh đặc trưng từ đó có thể nhận biết nơi có sự tương tác giữa kháng thể-kháng nguyên. Đây là phương pháp với thao tác đơn giản, giá thành thấp tuy nhiên không được sử dụng nhiều do có độ nhạy thấp hơn nhiều so với hoá phát quang và huỳnh quang.
Hình 5. Cơ chế hoạt động của kháng thể sơ cấp, kháng thể thứ cấp và cơ chế phát tín hiệu của hoá phát quang
(Duc Phuc Tran, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)
Khả năng định tính và định lượng của WB
- Đến nay, WB vẫn luôn được sử dụng trong các lĩnh vực sinh hoá, sinh học phân tử nhằm phân tích một loại protein nhất định. WB thường được biết đến như một phương pháp hiệu quả trong việc xác định sự hiện diện, kích thước của protein, quan sát khả năng tương tác giữa các protein với nhau. Vì vậy WB là kĩ thuật có khả năng định tính protein cao.
- Ngoài ra, kĩ thuật này có thể định lượng protein dựa vào cường độ các band trên màng. Tuy nhiên, WB chỉ định lượng protein tương đối, không thể chính xác hoàn toàn. Nếu sử dụng kháng thể thứ cấp có chất phát huỳnh quang, việc định tính sẽ đảm bảo tính ổn định hơn. Nhưng để định lượng chính xác protein, ta cần thực hiện các phương pháp khác hiệu quả hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Taylor, Sean C., and Anton Posch. “The design of a quantitative western blot experiment.” BioMed research international 2014.1 (2014): 361590. https://doi.org/10.1155/2014/361590
2. Roy, Jyoti, et al. “Small RNA proteome as disease biomarker: an incognito treasure of clinical utility.” AGO-driven non-coding RNAs. Academic Press, 2019. 101-136. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-815669-8.00005-1
3. Kurien, Biji T., and R. Hal Scofield. “Western blotting.” Methods 38.4 (2006): 283-293. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2005.11.007
4. Kurien, Biji T., and R. Hal Scofield. “Multiple immunoblots after non-electrophoretic bidirectional transfer of a single SDS–PAGE gel with multiple antigens.” Journal of immunological methods 205.1 (1997): 91-94. https://doi.org/10.1016/S0022-1759(97)00052-5
5. Peferoen, M., Roger Huybrechts, and Arnold De Loof. “Vacuum-blotting: a new simple and efficient transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to nitrocellulose.” FEBS Lett 145.2 (1982): 369-372. https://doi.org/10.1016/0014-5793%2882%2980202-0
6. abcam.com: Wester blot blocking methods and best practice. https://www.abcam.com/en-us/knowledge-center/western-blot/western-blot-blocking-methods#:~:text=Non%2Dfat%20dry%20milk%20(NFDM,on%20membranes%20in%20western%20blotting
7. Blake, M. S., et al. “A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots.” Analytical biochemistry 136.1 (1984): 175-179. https://doi.org/10.1016/0003-2697(84)90320-8
BÀI VIẾT MỚI >>
- Các phương pháp phân tích định lượng, định tính
Các phương pháp phân tích định lượng, định tính Giá trên đã bao gồm thuế phí. - Các phương pháp phân tích Sinh Hóa Lý
- Tổng quan về ELISA
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) là kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng enzyme để phát hiện và định lượng kháng nguyên hoặc kháng thể. Có […] - Các phương pháp chiết tách protein trong nghiên cứu proteomics và ứng dụng
Các tiến bộ trong công nghệ proteomics không thể khắc phục được các vấn đề trong chuẩn bị mẫu. Các bước như đồng nhất hóa mô, […] - Sự hình thành cầu disulfide trong protein
Tầm quan trọng của cầu nối Disulfide Ổn định cấu trúc Protein: Cầu nối disulfide giúp ổn định cấu trúc bậc ba và bậc bốn của […] - TỔNG QUAN WESTERN BLOTTING
Western Blotting (WB) là kĩ thuật phân tích protein được sử dụng rộng rãi trong ngành sinh hoá, sinh học phân tử. Là một kĩ thuật […] - Palmitoyl và khử palmitoyl: Vai trò trong sinh học tế bào và ung thư
Palmitoyl hóa là quá trình gắn nhóm palmitate vào protein, giúp điều chỉnh vị trí và chức năng của chúng. Quá trình này có thể đảo […] - Phân tích trình tự kháng thể: Khám phá sự đa dạng và ứng dụng
Cấu trúc kháng thể Kháng thể, còn được gọi là immunoglobulin, là một cấu trúc hình chữ Y bao gồm bốn chuỗi polypeptide – hai chuỗi […] - Giải trình tự peptide: Công cụ cốt lõi trong nghiên cứu Proteomics
Giải trình tự peptide là quá trình xác định trình tự các axit amin trong một chuỗi peptide. Đây là kỹ thuật then chốt trong proteomics, […] - Phân tích axit amin trong dinh dưỡng và công nghiệp thực phẩm
Axit amin đóng vai trò then chốt trong việc làm sáng tỏ mối quan hệ phức tạp giữa dinh dưỡng và ngành công nghiệp thực phẩm. […] - Phân tích axit amin trong kiểm soát chất lượng protein tái tổ hợp
Dược phẩm sinh học protein tái tổ hợp Rối loạn chức năng của các protein có trình tự axit amin bất thường hoặc không có […] - TỔNG QUAN VỀ SDS-PAGE
SDS-PAGE là gì? Điện di trên gel polyacrylamide biến tính với sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) là một kỹ thuật điện di protein phổ biến trong sinh […] - LIPID HÓA PROTEIN: CƠ CHẾ, PHÁT HIỆN VÀ CÁC BỆNH LÝ LIÊN QUAN
Protein lipid hóa là gì? Biến đổi sau dịch mã (PTMs) là những thay đổi hóa học xảy ra sau quá trình tổng hợp protein, liên […] - Lipid: Nhóm Phân Tử Đa Năng Trong Sinh Học và Công Nghệ
Lipid là một nhóm lớn các phân tử hữu cơ không phân cực, đặc trưng bởi tính kỵ nước (hydrophobic) và khả năng hòa tan trong […] - Glycosyl hóa: Biến đổi sau dịch mã và tác động lên cấu trúc chức năng protein
Con đường đường phân glycosyl hóa (Glycosylation pathway) là một quá trình biến đổi sau dịch mã (PTM) quan trọng, trong đó các gốc glycan được […] - Cách mạng hóa Proteomics: Tiến bộ trong công nghệ, tích hợp AI và ứng dụng rộng hơn
1. Sự phát triển của công nghệ Proteomics 1.1 Proteomics dựa trên khối phổ Proteomics dựa trên khối phổ là một lĩnh vực năng động và then […] - Phản ứng phân hủy Edman
Phản ứng phân hủy Edman là phương pháp giải trình tự protein được Pehr Edman công bố vào năm 1950. Phương pháp này giúp xác định […] - Applications of Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) in Protein Analysis for Biomedical Research
Applications of Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) in Protein Analysis for Biomedical Research 1. Giới thiệu Proteomics – nghiên cứu toàn bộ bộ protein của một hệ […] - Kỹ thuật định lượng không nhãn
Kỹ thuật định lượng không nhãn là gì? Ngày nay, các nghiên cứu về proteomics không còn chỉ tập trung vào việc xác định càng nhiều […] - Matrix effects and application of matrixeffect factor
Matrix effects and application of matrix effect factor 1. Thực trạng Hiện nay, LC-MS là một trong những kĩ thuật phân tích tối ưu nhất về […]
