TỔNG QUAN VỀ SDS-PAGE
14/03/2025
Phân tích axit amin trong dinh dưỡng và công nghiệp thực phẩm
21/03/2025
Phân tích axit amin trong kiểm soát chất lượng protein tái tổ hợp
Dược phẩm sinh học protein tái tổ hợp
Rối loạn chức năng của các protein có trình tự axit amin bất thường hoặc không có một protein nhất định thường dẫn đến sự phát triển của các bệnh lý nghiêm trọng như bệnh tiểu đường, rối loạn tăng trưởng hoặc đông máu. Vì những bệnh lý này vẫn chưa thể được điều trị thường xuyên bằng liệu pháp gen nên cần phải sử dụng protein chức năng được sản xuất ex vivo. Tuy nhiên, chiết xuất protein từ các nhà sản xuất tự nhiên và tổng hợp hóa học đều phải chịu những hạn chế cố hữu hạn chế sản xuất quy mô lớn thường xuyên, nên các công nghệ DNA tái tổ hợp đã nhanh chóng trở thành lựa chọn để sản xuất protein điều trị.
Với sự trưởng thành và ứng dụng của công nghệ kỹ thuật di truyền, giờ đây có thể thiết kế, sửa đổi và biểu hiện protein khi cần, dẫn đến một loạt các protein tái tổ hợp đa dạng. Việc sử dụng các liệu pháp peptide, liên hợp peptide trị liệu và protein trị liệu đã liên tục tăng trong những năm gần đây. Dược phẩm sinh học protein tái tổ hợp, được đặc trưng bởi tính đặc hiệu mạnh, yêu cầu liều lượng thấp và tác dụng phụ tối thiểu, đóng vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh.
Phân tích hàm lượng và thành phần axit amin
Hình 1 – Quá trình xác định protein sinh miễn dịch trong dược phẩm sinh học.
Nhu cầu ngày càng tăng về kiểm soát chất lượng của dược phẩm sinh học, dựa trên peptide hoặc protein. Một trong những phương pháp thường được sử dụng để mô tả và định lượng dược phẩm sinh học là phân tích axit amin kiểm soát chất lượng của các sản phẩm này trở nên đặc biệt quan trọng. Sự phát triển liên tục của công nghệ sinh học đã dẫn đến sự xuất hiện của các protein phức tạp với những thay đổi về cấu trúc do glycosyl hóa và PEGylation gây ra, khiến các phương pháp xác định hàm lượng truyền thống trở nên không hiệu quả.
Đối với các protein tái tổ hợp, dữ liệu ban đầu thường thu được là trình tự axit amin của chúng. Phân tích axit amin có thể xác định hàm lượng và thành phần axit amin của chúng, cũng như nồng độ protein và hệ số hấp thụ. Nó đóng vai trò then chốt trong kiểm soát chất lượng bằng cách xác định hàm lượng và tỷ lệ các gốc axit amin khác nhau tạo nên protein. Hơn nữa, đây là bước thiết yếu trước khi xác định trình tự đầy đủ của protein. Phân tích axit amin liên quan đến việc định lượng tuyệt đối các axit amin khác nhau cấu thành nên protein, cung cấp một phương pháp tiếp cận khách quan, ít can thiệp và tự động hóa cao với khả năng ứng dụng rộng rãi. Trong việc xác định hàm lượng protein, kiến thức được cho là về trình tự axit amin, cấu trúc polysaccharide và trọng lượng phân tử tương đối của protein có liên quan là rất cần thiết.
Xác định hàm lượng protein là một thông số quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng thuốc protein tái tổ hợp. Kết quả chính xác từ các xét nghiệm hàm lượng protein có ý nghĩa quan trọng đối với bao bì sản phẩm, tính toán hoạt động cụ thể, hạn chế kiểm soát tạp chất còn lại và các đánh giá tính chất lý hóa khác. Do đó, việc đạt được định lượng protein chính xác cho thuốc protein tái tổ hợp vẫn là một thách thức quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng dược phẩm công nghệ sinh học.
Các bước chính trong phân tích bao gồm:
- Thủy phân axit:
- Để phân tích chính xác, độ tinh khiết của protein thường phải lớn hơn 95%. Phương pháp thủy phân, thường sử dụng thủy phân axit, với việc loại bỏ axit và điều chỉnh thể tích theo các phương pháp phân tích axit amin tiêu chuẩn. Khi tính toán tỷ lệ mol tương đối của các axit amin khác nhau, việc lựa chọn một axit amin tham chiếu có tỷ lệ thu hồi 100% là rất quan trọng.
- Nói chung, một axit amin ổn định trong quá trình thủy phân, dễ dàng tách bằng sắc ký trao đổi ion hoặc một axit amin có hàm lượng cao hơn trong toàn bộ protein được chọn. Sự khác biệt giữa tỷ lệ mol tương đối đo được bằng thực nghiệm và giá trị lý thuyết phát sinh do nhiều yếu tố khác nhau. Thủy phân có thể gây ra sự phá hủy đáng kể các axit amin không ổn định (như serine và threonine), dẫn đến các giá trị đo được thấp hơn so với các giá trị lý thuyết. Ngoài ra, các axit amin có trở ngại không gian lớn, như isoleucine, có thể khó thủy phân, dẫn đến các giá trị đo được thấp hơn. Hơn nữa, các axit amin khác nhau có thể bị ảnh hưởng ở các mức độ khác nhau trong điều kiện thực nghiệm, dẫn đến độ lệch nhỏ so với các giá trị lý thuyết ngay cả khi được tính toán dựa trên axit amin tham chiếu.
- Do sự khác biệt trong quá trình thủy phân các axit amin khác nhau, nên sử dụng các axit amin có khả năng phục hồi tốt, chẳng hạn như Ala, Ser, Leu, Ile, Thr, Tyr, khi tính toán. Đối với các protein glycosyl hóa có hàm lượng đường cao, nên cân nhắc các phương pháp thay thế như khối phổ, HPLC hoặc ELISA để định lượng, vì những hạn chế của phân tích axit amin có thể phát huy tác dụng.
- Phân tách và phát hiện sắc ký: (ví dụ, trao đổi ion hoặc UHPLC-MS) để định lượng axit amin (sẽ được trình bày kỹ hơn ở phần sau)
- Lựa chọn axit amin tham chiếu:
- Thông tin về thành phần và tỷ lệ của các axit amin khác nhau thu được thông qua phân tích có ý nghĩa trong việc phân biệt sự khác biệt giữa các protein được biểu hiện bằng công nghệ sinh học và các protein tự nhiên tương ứng. Nó hỗ trợ xác định và xác nhận xem các đột biến có xảy ra như mong đợi hay không, cung cấp hướng dẫn có giá trị để kiểm soát chất lượng và xác nhận cấu trúc. Để có được thông tin cấu trúc chính xác hơn, nên kết hợp giải trình tự axit amin đầu N, phân tích lập bản đồ peptide, phân tích lưỡng sắc tròn, giải trình tự DNA hoặc phân tích khối phổ.
- Đối với các protein bị glycosyl hóa hoặc có tạp chất, nên sử dụng các phương pháp bổ sung như khối phổ hoặc ELISA.
- Sau khi mẫu trải qua quá trình phân tích axit amin để thu được hàm lượng của từng axit amin, tiếp theo là tính khối lượng của mẫu protein được phân tích bằng công thức:
Hàm lượng protein (W) = Trung bình [Hàm lượng axit amin/Số lượng axit amin này trong protein] × Trọng lượng phân tử tương đối của protein.
Định lượng chính xác hàm lượng protein
Hiện nay, các phương pháp được áp dụng rộng rãi như xét nghiệm Lowry, BCA và Bradford dựa vào phản ứng của các axit amin hoặc nhóm chức năng cụ thể trong protein, kết hợp với việc sử dụng các mẫu chuẩn hoặc mẫu đối chứng để định lượng. Mặc dù các phương pháp này thường đáp ứng các yêu cầu về định lượng protein tái tổ hợp, nhưng việc hiệu chuẩn chính xác các mẫu chuẩn hoặc mẫu đối chứng là rất quan trọng để đảm bảo độ tin cậy và độ chính xác của việc xác định hàm lượng protein.
Các phương pháp phổ biến nhất để định lượng tổng protein bao gồm: phân tích tỷ lệ cacbon/nitơ dựa trên quá trình đốt cháy (C/N) sử dụng phổ khối tỷ lệ đồng vị (IRMS) hoặc các kỹ thuật phân tích nguyên tố khác, phương pháp chuẩn độ Kjeldahl và các xét nghiệm biuret như phương pháp Lowry, phương pháp Bradford và phương pháp axit bicinchoninic. Phân tích IRMS dựa trên C/N và Kjeldahl rất nhạy và có thể tái tạo dựa trên mức độ phản ứng hóa học liên quan đến quá trình nhiệt phân và thủy phân mô, tuy nhiên có thể xảy ra hiện tượng giả tạo (ví dụ như nhiễm melamin hoặc pha tạp) và định lượng protein đòi hỏi phải có mô tả axit amin được cho là (tức là hệ số Jones)1.
Các phương pháp quang phổ và đo màu có thể được sử dụng để xác định mức protein nhưng có thể bị ảnh hưởng bởi các hợp chất khác1. Do đó, phương pháp quang phổ bị giới hạn trong việc phát hiện và định lượng protein hòa tan trong các điều kiện tương thích với phép thử tương ứng và dựa trên các chiến lược tinh chế protein phổ biến2. Một số protein sẽ bị mất do quá trình tinh chế, do đó, mục tiêu là đo tổng lượng protein hay một loại protein cụ thể là điều quan trọng cần xác định trước khi chọn phương pháp. Ngoài ra, thành phần và trình tự axit amin ảnh hưởng đến độ chính xác của các phương pháp quang phổ, do đó, ứng dụng chính là định lượng protein tinh khiết đã biết so với chuẩn đã đo hoặc so sánh tương đối giữa các mẫu tương tự. Điều quan trọng là không có phương pháp nào được mô tả đo thành phần axit amin.
Xác định nitơ Kjeldahl hoặc phân tích axit amin thường được sử dụng để hiệu chuẩn mẫu chuẩn hoặc mẫu đối chứng trong việc xác định hàm lượng protein. Cả hai phương pháp đều được công nhận là “tiêu chuẩn vàng”, mặc dù xác định nitơ Kjeldahl có thể có những hạn chế do yêu cầu về thể tích mẫu lớn hơn, hạn chế ứng dụng của nó ở một mức độ nào đó. Trong trường hợp mẫu khó lấy hoặc có thể tích hạn chế, lợi thế của việc sử dụng phân tích axit amin để định lượng trở nên rõ ràng1.
Các axit amin có hoặc không có dẫn xuất được tách bằng cách sử dụng sắc ký lỏng hiệu suất cao (UHPLC/UPLC hoặc HPLC), sắc ký khí (GC) hoặc điện di mao quản (CE) trước khi phát hiện bằng phương pháp hấp thụ, huỳnh quang hoặc khối phổ (MS). MS liên kết với GC (tức là GC–MS) có thể tránh được điều sau nhưng các dẫn xuất hóa thông thường như silylation làm tăng độ bay hơi của hợp chất cũng làm giảm độ ổn định và có thể làm phân hủy các axit amin hoặc tạo ra nhiều sản phẩm phản ứng làm phức tạp các phân tích. Ngoài ra, các tiêu chuẩn dẫn xuất hóa phải được làm mới trước mỗi lần phân tích1.
Gần đây hơn, MS đã được sử dụng để phân tích axit amin vì phương pháp này cụ thể hơn và ít bị nhiễu hơn các phương pháp đã thảo luận trước đó và hơn nữa, nó có thời gian phân tích nhanh hơn các máy phân tích axit amin. MS có thể được kết hợp với LC để phân tích axit amin, nhưng việc truyền trực tiếp mẫu bệnh nhân vào MS mà không sử dụng LC cũng đã được sử dụng và điều này có thể làm giảm đáng kể thời gian phân tích mẫu. Tuy nhiên, một nhược điểm của việc truyền trực tiếp vào MS mà không sử dụng LC là các axit amin đồng phân không thể tách ra và do đó không thể định lượng độc lập như khi sử dụng LC-MS/MS3. Sắc ký lỏng không yêu cầu dẫn xuất để tăng độ bay hơi và khi kết hợp với khối phổ song song (LC–MS/MS) cung cấp một tập hợp các kỹ thuật kết nối đang phát triển để bổ sung cho phân tích hợp chất phân cực. LC–MS/MS có độ chọn lọc cao và nhạy cảm với việc phát hiện cả axit amin dẫn xuất; tuy nhiên, việc kết hợp LC với MS bị hạn chế ở các dung môi dễ bay hơi tương thích trừ khi các quy trình khử muối bổ sung được đưa vào. LC–MS/MS đã cho phép thông lượng nhanh với các cột pha đảo ngược để phân giải hầu hết các axit amin. Thuốc thử cặp ion cải thiện thêm độ phân giải nhưng làm nhiễm bẩn hệ thống MS, dẫn đến tín hiệu bị ức chế và ảnh hưởng đến độ nhạy cho các ứng dụng khác1.
Các cột sắc ký lỏng tương tác ưa nước (HILIC) có khả năng tránh được những khó khăn này. Các cột HILIC phân chia nội dung giữa pha động kỵ nước đáng kể với pha tĩnh đủ ưa nước để giữ lại các hợp chất hòa tan một phần trong nước. Việc giữ lại các hợp chất phân cực hỗ trợ quá trình tách và trong một số trường hợp đã cho phép phân giải các hợp chất đẳng áp. Gần đây, các phương pháp dựa trên HILIC đã được sử dụng để phân giải thành công cả axit amin sinh protein và không sinh protein cho các ma trận động vật và thực vật. Bằng cách ghép nối với khối phổ song song, HILIC có thể được sử dụng để phát hiện và định lượng nhạy cảm hàm lượng protein mà không cần bổ sung sắc tố hoặc các dẫn xuất khác và sẽ cho phép phân giải tất cả các đồng vị axit amin khi các ứng dụng chuyển hóa với nhãn đồng vị được quan tâm.
Tính toán hệ số hấp thụ trong sản phẩm protein
Hệ số hấp thụ là một hằng số duy nhất đối với các sản phẩm protein và đóng vai trò là nền tảng để thiết lập các tiêu chuẩn có liên quan, theo khuyến nghị của ICH Q6B. Hệ số hấp thụ E₀.₁% biểu thị độ hấp thụ của dung dịch protein 1 mg/ml hoặc 0,1% khối lượng/thể tích trong cuvet 1 cm. Hệ số này có thể được tính toán dựa trên kết quả phân tích axit amin của protein tương ứng hoặc thu được từ thông tin trình tự của protein. Mặc dù cách sau thuận tiện hơn, nhưng nó có những hạn chế thực tế. Một mặt, hầu hết các loại thuốc protein tái tổ hợp là protein tổng hợp hoặc protein đột biến thu được thông qua kỹ thuật di truyền, khiến việc xác định hệ số hấp thụ của chúng trở nên khó khăn. Mặt khác, việc bổ sung tá dược và chất phụ gia vào công thức protein có thể làm thay đổi độ pH của mẫu, ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa của các gốc tyrosine và sau đó ảnh hưởng đến độ hấp thụ của protein. Do đó, hệ số hấp thụ chính xác thường được xác định bằng cách sử dụng phân tích axit amin.
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hấp thụ bao gồm thành phần axit amin của protein và môi trường vi mô mà protein nằm trong đó. Các thành phần phenylalanine, tyrosine, tryptophan và cysteine là các yếu tố ảnh hưởng chính. Trong các xác định thực tế, nên phân tích chi tiết dựa trên các đặc điểm cụ thể của protein. Ngoài ra, việc kết hợp các phương pháp khác có thể cung cấp một cách tiếp cận toàn diện để xác định hệ số hấp thụ.
Tối ưu hóa biểu hiện protein tái tổ hợp:
- Vị trí +2 axit amin: Ala, Ser, Thr, Lys, Pro hoặc Cys ở vị trí +2 (sau codon khởi đầu) làm tăng cường biểu hiện ở E. coli lên đến 10 lần so với Met, His hoặc Glu4.
- Chiến lược bổ sung: Việc bổ sung các axit amin thúc đẩy tăng trưởng (ví dụ, trong môi trường được xác định về mặt hóa học) làm giảm căng thẳng chuyển hóa trong quá trình sản xuất. Ví dụ, việc bổ sung có mục tiêu làm tăng sản lượng pramlintide lên 40% (3,09 g/L) trong khi điều chỉnh giảm các gen phản ứng với căng thẳng5.
Uyen Nguyen (Research Officer, Hoan Vu Biomolecules., JSC.)
Tài liệu tham khảo
1. S. Kambhampati, J. Li, B. S. Evans, and D. K. Allen. Accurate and efficient amino acid analysis for protein quantification using hydrophilic interaction chromatography coupled tandem mass spectrometry, Plant Methods 2019, 15(1), 46.
2. J. E. Noble and M. J. Bailey. Quantitation of protein, Methods Enzymol 2009, 463, 73-95.
3. D. French, Chapter Five – Advances in Clinical Mass Spectrometry, in Advances in Clinical Chemistry, G.S. Makowski, Editor. 2017, Elsevier. p. 153-198.
4. L. Bivona, Z. Zou, N. Stutzman, and P. D. Sun. Influence of the second amino acid on recombinant protein expression, Protein Expr Purif 2010, 74(2), 248-56.
5. J. Kumar, A. S. Chauhan, R. L. Shah, J. A. Gupta, and A. S. Rathore. Amino acid supplementation for enhancing recombinant protein production in E. coli, Biotechnol Bioeng 2020, 117(8), 2420-2433.
BÀI VIẾT MỚI
- Các phương pháp phân tích định lượng, định tính
Các phương pháp phân tích định lượng, định tính Giá trên đã bao gồm thuế phí. - Các phương pháp phân tích Sinh Hóa Lý
- Tổng quan về ELISA
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) là kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng enzyme để phát hiện và định lượng kháng nguyên hoặc kháng thể. Có […] - Các phương pháp chiết tách protein trong nghiên cứu proteomics và ứng dụng
Các tiến bộ trong công nghệ proteomics không thể khắc phục được các vấn đề trong chuẩn bị mẫu. Các bước như đồng nhất hóa mô, […] - Sự hình thành cầu disulfide trong protein
Tầm quan trọng của cầu nối Disulfide Ổn định cấu trúc Protein: Cầu nối disulfide giúp ổn định cấu trúc bậc ba và bậc bốn của […] - TỔNG QUAN WESTERN BLOTTING
Western Blotting (WB) là kĩ thuật phân tích protein được sử dụng rộng rãi trong ngành sinh hoá, sinh học phân tử. Là một kĩ thuật […] - Palmitoyl và khử palmitoyl: Vai trò trong sinh học tế bào và ung thư
Palmitoyl hóa là quá trình gắn nhóm palmitate vào protein, giúp điều chỉnh vị trí và chức năng của chúng. Quá trình này có thể đảo […] - Phân tích trình tự kháng thể: Khám phá sự đa dạng và ứng dụng
Cấu trúc kháng thể Kháng thể, còn được gọi là immunoglobulin, là một cấu trúc hình chữ Y bao gồm bốn chuỗi polypeptide – hai chuỗi […] - Giải trình tự peptide: Công cụ cốt lõi trong nghiên cứu Proteomics
Giải trình tự peptide là quá trình xác định trình tự các axit amin trong một chuỗi peptide. Đây là kỹ thuật then chốt trong proteomics, […] - Phân tích axit amin trong dinh dưỡng và công nghiệp thực phẩm
Axit amin đóng vai trò then chốt trong việc làm sáng tỏ mối quan hệ phức tạp giữa dinh dưỡng và ngành công nghiệp thực phẩm. […] - Phân tích axit amin trong kiểm soát chất lượng protein tái tổ hợp
Dược phẩm sinh học protein tái tổ hợp Rối loạn chức năng của các protein có trình tự axit amin bất thường hoặc không có […] - TỔNG QUAN VỀ SDS-PAGE
SDS-PAGE là gì? Điện di trên gel polyacrylamide biến tính với sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) là một kỹ thuật điện di protein phổ biến trong sinh […] - LIPID HÓA PROTEIN: CƠ CHẾ, PHÁT HIỆN VÀ CÁC BỆNH LÝ LIÊN QUAN
Protein lipid hóa là gì? Biến đổi sau dịch mã (PTMs) là những thay đổi hóa học xảy ra sau quá trình tổng hợp protein, liên […] - Lipid: Nhóm Phân Tử Đa Năng Trong Sinh Học và Công Nghệ
Lipid là một nhóm lớn các phân tử hữu cơ không phân cực, đặc trưng bởi tính kỵ nước (hydrophobic) và khả năng hòa tan trong […] - Glycosyl hóa: Biến đổi sau dịch mã và tác động lên cấu trúc chức năng protein
Con đường đường phân glycosyl hóa (Glycosylation pathway) là một quá trình biến đổi sau dịch mã (PTM) quan trọng, trong đó các gốc glycan được […] - Cách mạng hóa Proteomics: Tiến bộ trong công nghệ, tích hợp AI và ứng dụng rộng hơn
1. Sự phát triển của công nghệ Proteomics 1.1 Proteomics dựa trên khối phổ Proteomics dựa trên khối phổ là một lĩnh vực năng động và then […] - Phản ứng phân hủy Edman
Phản ứng phân hủy Edman là phương pháp giải trình tự protein được Pehr Edman công bố vào năm 1950. Phương pháp này giúp xác định […] - Applications of Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) in Protein Analysis for Biomedical Research
Applications of Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) in Protein Analysis for Biomedical Research 1. Giới thiệu Proteomics – nghiên cứu toàn bộ bộ protein của một hệ […] - Kỹ thuật định lượng không nhãn
Kỹ thuật định lượng không nhãn là gì? Ngày nay, các nghiên cứu về proteomics không còn chỉ tập trung vào việc xác định càng nhiều […] - Matrix effects and application of matrixeffect factor
Matrix effects and application of matrix effect factor 1. Thực trạng Hiện nay, LC-MS là một trong những kĩ thuật phân tích tối ưu nhất về […]
