Matrix effects and application of matrixeffect factor

Mass spectrometry-based proteomics as an emerging tool in clinical laboratories

03/03/2025

A diagram of a cell block Description automatically generated with medium confidence

Kỹ thuật định lượng không nhãn

05/03/2025

Published by admin on 03/03/2025

A diagram of a chemical structure AI-generated content may be incorrect.

Matrix effects and application of matrix effect factor

1. Thực trạng

Hiện nay, LC-MS là một trong những kĩ thuật phân tích tối ưu nhất về phân tích định lượng nhưng kĩ thuật này vẫn vướng phải các vấn đề do Hiệu ứng nền (matrix effect) gây nên, đặc biệt khi dùng nguồn ion hoá phun điện (ESI). Nguyên nhân chính dẫn đến hiện tượng này là sự gia tăng hoặc sự giảm sút của ion từ chất đang phân tích khi thực hiện LC-MS. Cả hai trường hợp đều có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả phân tích của kĩ thuật này. Vì vậy, hiệu ứng nền cần phải được dự đoán, giảm thiểu và khắc phục.

2. Mục tiêu:

Bài báo trình bày nguyên nhân dẫn đến matrix effect trong LC-MS đồng thời đưa ra các giải pháp đánh giá, hạn chế và khắc phục hiện tượng này.

3. Vật liệu và phương pháp

3.1. Nguyên nhân dẫn đến Hiệu ứng nền

Hiệu ứng nền đầu tiên được phát hiện khi dùng LC-MS với nguồn ion hoá phun điện (ESI). Có nhiều nguyên nhân dẫn đến Hiệu ứng nền chủ yếu đền từ các thành phần của ma trận chiếm đoạt, ngăn không cho chất mục tiêu nhận điện tích, hoặc chúng can thiệp vào khả năng duy trì trạng thái tích điện của mục tiêu khi ở pha khí, làm tăng áp lực bề mặt hoặc làm tăng tính cách điện. Bất kì quá trình nào làm thay đổi khả năng ion hoá ở pha lỏng, pha khí đều dẫn đến Hiệu ứng nền, vì vậy hiện tượng này thường gặp khi dùng nguồn ESI nhiều hơn so với nguồn APPI và APCI.

3.2. Đánh giá Hiệu ứng nền

3.2.1. Postcolumn infusion

Phương pháp này sử dụng 1 ống hình chữ T nối hệ thống ống bơm LC và ống bơm dung môi chuẩn. Mẫu sẽ được đưa vào hệ thống LC, các thành phần trong mẫu sẽ được tách ra khi đi qua cột sắc kí. Ở phía ống bơm còn lại, dung môi chuẩn (standard solution) sẽ được bơm. Các chất sau khi phân tích và dung môi sẽ phản ứng với nhau tại ống nối chữ T để tạo một chất mới dễ phát hiện tín hiệu hơn. Hỗn hợp các chất được tách ra từ mẫu và dung môi sau đó đi đến ESI-MS. Vì sắc kí đồ tổng ion không phản ánh hiệu ứng nền của từng chất phân tích nên cần dùng SIM và SRM để phân tích.

3.2.2. Bổ sung sau ly trích (Postextraction addition protocol)

Bổ sau sung lý trích là phương pháp dùng thêm một chất (thường là chất chuẩn) vào mẫu sau khi ly trích mẫu. Sau khi bổ sung, mẫu sẽ được đem đi phân tích LC-MS và thu nhận kết quả. Hiệu ứng nền được đánh giá qua công thức sau:

$Matrix\: effect\: (ME) = \frac{A - B}{A} \times 100$

Trong đó:

Matrix effect (ME): Hiệu ứng nền (%).

A: peak area của chất phân tích trong dung môi chuẩn.

B: peak area của chất phân tích trong mẫu.

Nếu ME ~ 0% thì không có hiệu ứng nền. Nếu ME > 0%, hiện tượng ức chế ion đã diễn ra, ME < 0% ion được tăng cường. Để kết quả đáng tin cậy hơn, cần so sánh ma trận với đường chuẩn của dung môi đã dùng. Nếu thấp hơn thì có ức chế ion, cao hơn thì có tăng cường ion.

3.3. Các phương pháp hạn chế hiệu ứng nền

Hiệu ứng nền không thể được loại bỏ hoàn toàn, nó chỉ có thể giảm thiểu bằng cách tối ưu hoá quá trình chuẩn bị mẫu hay điều chỉnh các điều kiện, thông số trong LC và MS.

Cách đơn giản nhất là giảm thể tích bơm hoặc pha loãng mẫu để giảm lượng chất đồng rửa giải từ đó giảm hiệu ứng nền.

Một số cách khác để giảm hiệu ứng nền: thay đổi lưu lượng, giảm tốc độ gradient program, postcolumn split, mixed-mode column, hệ thống micro hoặc nano LC và 2D LC.

3.3.1. Dùng nguồn API

Đối với các chất ít phân cực, dễ bay hơi, và bền nhiệt, nếu chúng có thể ion hoá bằng nhiều nguồn khác nhau (ESI, APPI, APCI), APCI và APPI thường sẽ được ưu tiên sử dụng.

Khi dùng nguồn APPI, quá trình phân giải chỉ làm bay hơi các chất dễ bay hơi, bán bay hơi vì vậy, khi sử dụng nguồn APPI thường sẽ ít gặp hiệu ứng nền hơn ESI.

3.3.2. Dùng nội chuẩn (internal standard)

Hợp chất tương đồng cấu trúc (structural analogs) và hợp chất được đánh dấu đồng vị (SIL) thường được dùng làm nội chuẩn để ước lượng, hiệu chuẩn hiệu ứng nền. SIL được dùng làm nội chuẩn (SIL-IS) thường được sử dụng nhiều hơn vì chúng có cấu trúc, tính chất sắc kí tương đồng với chất phân tích.

SIL-IS là các hợp chất có cấu trúc, đặc tính tương đồng với chất phân tích nhưng trong đó một số nguyên tử được thay thế bằng các đồng vị bền: ²H (D), ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O/¹⁸O. Sự thay đổi này không làm ảnh hưởng đến tính chất hoá học nhưng thay đổi khối lượng của chúng (khác nhau ít nhất 3 Da để phân biệt giữa chất phân tích và SIL-IS).

SIL-IS sẽ được thêm vào mẫu trước khi phân tích. Kết quả nhận được sẽ có 2 tín hiệu, 1 của mẫu và 1 của nội chuẩn, bằng cách so sánh tín hiệu của cả 2, có thể ước lượng được hiệu ứng nền đã xảy ra. Dùng SIL-IS chỉ có thể dự đoán, bù trừ hiệu ứng nền, không thể loại bỏ hoàn toàn.

3.3.3. Dùng thêm chất chuẩn

Nếu không thể sử dụng SIL-IS, có thể dùng thêm một chất chuẩn khác để ước lượng hiệu ứng nền. Tuy nhiên cách này sẽ tốn nhiều thời gian và không phù hợp phân tích số lượng lớn vì mỗi một mẫu sẽ cần chuẩn bị một chuẩn khác nhau. Tương tự SIL-IS, cách này không hạn chế, giảm hiệu ứng nền mà chỉ dùng để bù trừ hiện tượng này.

3.3.4. Chuẩn bị, làm sạch mẫu trước khi phân tích

Một trong những cách đơn giản nhất để loại bỏ các thành phần đồng rửa giải là chuẩn bị, làm sách mẫu thật kĩ trước khi phân tích. Một số phương pháp để làm sạch mẫu bao gồm: phân cách, lọc, tủa, pha loãng, ly tâm, siêu âm và một số cách ly trích khác

Tuỳ vào loại mẫu, tính chất của chất phân tích mà sử dụng các phương pháp ly trích khác nhau: tủa protein (protein percipitation), ly trích lỏng-lỏng (liquid-liquid extraction – LLE), ly trích pha rắn (solid phase extraction – SPE), và phương pháp chuẩn bị mẫu QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)

3.4. Hiệu ứng nền toàn diện và các yếu tố gây hiệu ứng nền (matrix effect factor – MEF)

Khác với hiệu ứng nền, nơi chỉ xác định các chất gây nhiễu cụ thể lên kết quả phân tích, hiệu ứng nền toàn diện bao quát tất cả các yếu tố có thể gây nhiễu bao gồm cả các chất có nồng độ nhỏ nhất hoặc các chất không thể xác định khi phân tích. Hiện tượng này cần các phương pháp toàn diện hơn để loại bỏ sai số vì không thể loại bỏ hoàn toàn các chất gây nhiễu.

Để phân biệt hiệu ứng nền và hiệu ứng nền toàn diện, yếu tố gây hiệu ứng nền (matrix effect factor – MEF) được xác định bằng công thứ sau:

$Matrix\: effect\: factor\: (MEF)=\frac{[Avg\: Area\: IS\: Stds]- [Area\: IS\: sample]}{[Avg\: Area\: IS\: Stds]}\times 100$

Trong đó:

Matrix effect factor (ME): yếu tố gây hiệu ứng nền.
Avg_Area_IS_Stds: Trung bình diện tích của tín hiệu thu được từ SIL-IS trong chuẩn.
Area_IS_sample: Diện tích của tín hiệu thu được từ SIL-IS trong mẫu.

Nếu MEF ~ 0%, không có hiệu ứng nền toàn diện xảy ra.

Nếu trị tuyệt đối MEF của mẫu ngưỡng trong quá trình xác nhận phương pháp thì kết quả vẫn sẽ được chấp nhận (thường sẽ là 85%). Nếu không thoả điều kiện này, mẫu cần phải được pha loãng hoặc chuẩn bị thêm để giảm hiệu ứng nền.

Ngoài ra, tỷ lệ ion cũng được tính để ước lượng hiệu ứng nền với công thức:

$Ion\: ratio=\frac{Peak\: area\: (confirmation\: ion)}{Peak\: area\: (quantitation\: ion)}\times 100$

Trong đó:

Ion ratio: tỷ lệ ion (%).
Peak area (confirmation ion): là diện tích tín hiệu chuyển tiếp được SRM xác định (chuyển tiếp SRM thứ cấp) của chất phân tích trong mẫu hoặc chuẩn.
Peak area (quantitation ion): diện tích tín hiệu chuyển tiếp SRM sơ cấp của chất phân tích trong chuẩn hoặc mẫu.