LIPID HÓA PROTEIN: CƠ CHẾ, PHÁT HIỆN VÀ CÁC BỆNH LÝ LIÊN QUAN
14/03/2025
Phân tích axit amin trong kiểm soát chất lượng protein tái tổ hợp
21/03/2025
TỔNG QUAN VỀ SDS-PAGE
SDS-PAGE là gì?
Điện di trên gel polyacrylamide biến tính với sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) là một kỹ thuật điện di protein phổ biến trong sinh hóa và sinh học phân tử. Kỹ thuật này phân tách các protein dựa trên khối lượng phân tử của chúng.
Nguyên lí hoạt động của SDS-PAGE
SDS-PAGE sử dụng SDS, β-mercaptoethanol hoặc dithiothreitol (DTT) để biến tính protein từ các cấu trúc bậc 3, bậc 4 về cấu trúc đơn gỉản hơn, đồng thời SDS kết hợp với protein tạo phức protein-SDS giúp quá trình điện di thuận tiện hơn. Môi trường điện di được sử dụng là polyacrylamide gel, với cấu trúc không gian cùng các lỗ hỗ trợ việc phân tách protein.
Biến tính protein
- Trước khi điện di, mẫu protein được xử lý với SDS, một chất hoạt động bề mặt anion.
- SDS phá vỡ các liên kết không cộng hóa trị trong protein, bao gồm liên kết hydro và liên kết kỵ nước, làm cho protein mất cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn.
- SDS cũng gắn vào chuỗi polypeptide của protein, tạo ra một phức hợp protein-SDS có điện tích âm đồng đều.
- Ngoài ra, β-mercaptoethanol hoặc dithiothreitol (DTT) được thêm vào để phá vỡ liên kết disulfide, giúp loại bỏ hoàn toàn cấu trúc bậc ba của protein.
Trùng hợp Polyacrylamide gel
• Gel polyacrylamide được tạo thành từ phản ứng trùng hợp giữa acrylamide và chất liên kết chéo N,N’-methylenebisacrylamide.
• Phản ứng này được xúc tác bởi ammonium persulfate (APS) và N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED).
• Khi các monome acrylamide liên kết với nhau và với chất liên kết chéo, chúng tạo thành một mạng lưới polymer ba chiều. Mật độ của mạng lưới này có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi nồng độ acrylamide và chất liên kết chéo, từ đó điều chỉnh kích thước lỗ gel.
- Tốc độ phản ứng trùng polyacrylamide hợp phụ thuộc vào tỷ lệ nồng độ acrylamide : N,N’-methylenebisacrylamide; nồng độ của APS và TEMED.
Phân tách protein
• Mẫu protein đã được xử lí SDS được nạp vào giếng trên gel polyacrylamide và đặt trong điện trường.
• Do SDS tích điện âm cho các protein đã được xử lí, các phức hợp protein-SDS di chuyển về phía cực dương.
• Tốc độ di chuyển của protein qua gel phụ thuộc vào kích thước của chúng. Các protein nhỏ hơn di chuyển nhanh hơn qua các lỗ gel, trong khi các protein lớn hơn di chuyển chậm hơn.
• Vì SDS đã tạo ra điện tích âm tỉ lệ thuận với khối lượng phân tử của protein, nên sự di chuyển của chúng trong gel chỉ phụ thuộc vào khối lượng phân tử.
• Sau khi điện di, các protein được phân tách thành các band riêng biệt trong gel, mỗi band tương ứng với một protein có khối lượng phân tử nhất định.
Phát hiện protein
• Sau khi điện di, gel được nhuộm bằng thuốc nhuộm protein, chẳng hạn như Coomassie Brilliant Blue, để hiển thị các band protein.
- Sau đó, gel được tẩy nhuộm và sấy khô để quan sát kết quả.
• Khối lượng phân tử của protein có thể được ước tính bằng cách so sánh vị trí của các băng protein với các protein chuẩn có khối lượng phân tử đã biết.
Quy trình chuẩn bị mẫu và thực hiện SDS-PAGE
Hình 1. Sơ đồ tổng quát SDS-PAGE
(Duc Phuc Tran, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)
Chuẩn bị mẫu
Quá trình chuẩn bị trước khi thực hiện SDS-PAGE gồm các bước như sau:
- Chiết xuất mẫu: tuỳ vào loại mẫu sẽ có cách chiết xuất phù hợp, các phương pháp phổ biến gồm: ly giải tế bào, nghiền mô, dùng kit chiết xuất,…
- Đo nồng độ protein: để đảm bảo lượng protein đã chiết xuất đủ để thực hiện SDS-PAGE, cần phải có bước đo nồng độ. Một số phương pháp đo tổng hàm lượng protein phổ biến: Bradford, BCA,…
- Chuẩn bị dung dịch đệm: dung dịch đệm mẫu có các thành phần chính được trình bày ở Bảng 1.
- Chuẩn bị mẫu: hoà tan mẫu với dung dịch đệm với nồng độ phù hợp, đun nóng mẫu ở 100 oC trong 5 phút để protein biến tính hoàn toàn, ly tâm nhẹ để loại bỏ tạp chất trong mẫu.
- Trữ mẫu: nếu cần thiết trữ mẫu, mẫu đã được chuẩn bị phải được trữ ở -20 oC.
Bảng 1. Thành phần chính của dung dịch đệm mẫu SDS-PAGE
(Duc Phuc Tran, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)
| Thành phần | Vai trò |
| Tris-HCl pH 6.8 | Duy trì pH của mẫu |
| Glycerol | Giúp mẫu chìm xuống giếng điện di sau khi bơm |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Phá huỷ liên kết hydro, liên kết kị nước của protein, tạo phức protein-SDS, thay đổi diện tích protein |
| Bromophenol blue | Nhuộm mẫu |
| β-mercaptoethanol hoặc dithiothreitol, DTT | Chất xúc tác SDS thực hiện biến tính protein, là chất độc, cần sử dụng tủ hút và đeo bao tay khi dùng |
Chuẩn bị Polyacrylamide Gel
Polyacrylamide Gel trong kĩ thuật SDS-PAGE thường bao gồm 2 loại gel: Stacking gel ở phía trên và Separating gel (resolving gel) ở phía dưới. Điểm khác nhau giữa 2 loại này là nồng độ acrylamide và độ pH của Tris-HCl đã sử dụng để pha gel.
- Stacking gel: thành phần chính gồm: Tris-HCl pH 6.8, acrylamide (4-5%), SDS, APS, TEMED. Vai trò của Stacking gel là tập trung protein thành band, chuẩn bị quá trình tách ở Separating gel.
- Separating gel: thành phần chính gồm: Tris-HCl pH 8.8, acrylamide (7.5-15%), SDS, APS, TEMED. Vai trò của Separating gel là tạo mạng lưới với các lỗ nhỏ, cho phép protein chạy qua, từ đó phân tách protein thành các band.
Tris-Glycine Buffer
Tris-Glycine buffer là dung dịch đệm thường dùng cho quá trình điện di. Thành phần của buffer này bao gồm Tris base và Glycine. Trong đó, Tris sẽ giữ pH ổn định trong suốt quá trình điện di, Glycine có vai trò quan trọng hơn, tuỳ vào độ pH nơi Glycine chạy qua mà nó có vai trò khác nhau:
- Stacking gel (pH 6.8): glycine mang điện tích âm yếu, di chuyển chậm hơn ion Cl–. Khi protein chạy trong stacking gel, nó sẽ di chuyển giữa glycine và Cl-. Quá trình này khiến protein bị nén lại thành các band, chuẩn bị cho việc phân tách ở separating gel.
- Separating gel (pH 8.8): glycine mang điện tích âm mạnh hơn, di chuyển nhanh hơn cả protein, từ đó phân cách các protein dựa trên khối lượng phân tử của chúng.
Marker khối lượng phân tử protein
SDS-PAGE là kĩ thuật xác định khối lượng phân tử của protein. Để đối chiếu, xác định khối lượng phân tử trong phòng thí nghiệm, một loại protein đã biết khối lượng phân tích và được gắn sẵn thuốc nhuộm sẽ được dùng làm thang đo chuẩn để đối chiếu từ đó có thể xác định kích thước của protein cần phân tích.
Nhuộm gel sau điện di
Gel sau khi hoàn tất điện di không thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường, vậy nên cần nhuộm gel với dung dịch nhuộm Coomassie Blue. Thành phần chính của dung dịch bao gồm: Coomassie Brilliant Blue, methanol, acid acetic đông lạnh. Khi chuẩn bị thuốc nhuộm Coomassie Blue cần chú ý cẩn trọng, sử dụng tủ hút và bao tay.
Ngoài Coomassie Blue, hiện nay còn các phương pháp nhuộm khác: đánh dấu huỳnh quang, đánh dấu đồng vị. Các phương pháp này cải thiện độ nhạy, và khả năng thích ứng với tự động hoá, tiết kiệm thời gian và đều có khả năng định lượng tốt.
Bảng 2. So sánh các loại thuốc nhuộm của SDS-PAGE
(Duc Phuc Tran, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)
| Loại nhuộm | Cơ chế | Ưu điểm | Nhược điểm |
| Coomassie Blue | Chất nhuộm liên kết không đặc hiệu với protein, nhuộm trực tiếp vào gel sau điện di | Đơn giản, có nhiều ứng dụng Giá thành thấp | Khả năng định lượng hạn chế, tốn nhiều thời gian |
| Gắn nhãn huỳnh quang (Fluorescent labelling) | Dùng chất nhuộm có khả năng tạo huỳnh quang (Nile red staining solution). Phát hiện protein bằng cách đo cường độ huỳnh quang | Có thể dùng cho mẫu với nồng độ thấp Độ nhạy cao Định lượng tốt | Giá thành cao Cần thiết bị chuyên dụng |
| Gắn nhãn đồng vị (Isotope labelling) | Sử dụng đồng vị bền (deuterium, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-18) để dánh dấu protein | Độ chính xác, độ nhạy cao Định lượng chính xác | Cần thiết bị chuyên dụng Phức tạp Giá thành cao |
Tẩy nhuộm và sấy khô gel
Sau khi sử dụng nhuộm Coomassie Blue cần phải có bước tẩy nhuộm để loại bỏ nhuộm dư thừa trên gel. Quá trình tẩy sẽ dùng 2 loại thuốc tẩy Destaining A và Destaining B. Cả 2 loại thuốc tẩy đều có thành phần chính giống nhau là methanol, acid acetic, điểm khác biệt là nộng độ của các chất trong 2 dung dịch:
- Destaining A: nồng độ methanol và acid acetic cao, dùng sau khi nhuộm. Destaining A có tác dụng co nhỏ gel và rút nước còn thừa trong gel.
- Destaining B: nồng độ methanol và acid acetic thấp hơn Destaining A, dùng sau khi tẩy với Destaining A. Dùng để rửa gel, giúp thuận tiện quan sát.
Sau khi tẩy nhuộm, gel sẽ sấy khô và ghi nhận kết quả.
Bảo quản gel SDS-PAGE
Gel SDS-PAGE thường được chuẩn bị ngay trước khi thực hiện thử nghiệm. Tuy nhiên khi cần phải trữ, gel có thể được trữ trong -4 oC trong khoảng 1 tuần. Nếu không thể thu nhận kết quả sau khi nhuộm, gel cần được ngâm với nước tránh tính trạng gel tự động co nhỏ, thoát nước. Tuy nhiên nếu ngâm gel quá lâu có thể dẫn đến tình trạng band thoát khỏi gel.
SDS-PAGE và LC-MS
LC-MS là kĩ thuật phân tích vận dụng sắc kí lỏng (LC) và khối phổ (MS) để xác định, định lượng các hợp chất trong hỗn hợp với độ nhạy và độ hiệu quả cao. Kĩ thuật này được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như: phân tích thực phẩm, môi trường, dược phẩm proteomics,…
SDS-PAGE và LC-MS là hai kĩ thuật bổ sung cho nhau, thường được kết hợp để phân tích rõ protein. Trong đó, SDS-PAGE làm đơn giản hoá số lượng mẫu cần phân tích ở LC-MS. Ngược lại, LC-MS phân tích, định lượng chính xác các hợp chất trong gel SDS-PAGE. Một số lợi ích khi kết hợp 2 kĩ thuật SDS-PAGE, LC-MS cùng nhau:
- Cải thiện độ nhạy: sau khi điện di, protein trên gel SDS-PAGE đã được phân tách dựa trên kích thước của chúng và đã được loại bỏ phần lớn các tạp chất không mong muốn. Điều này cải thiện độ nhạy của phân tích LC-MS
- Giảm hiệu ứng nền: trong quá trình phân tích LC-MS, hiệu ứng nền (matrix effect) có thể xảy ra do mẫu không được chuẩn bị kĩ lưỡng. Sau khi thực hiện SDS-PAGE, phần lớn các tạp chất không mong muốn đã được loại bỏ, vậy nên kết hợp 2 kĩ thuật này có thể giảm đáng kể hiện tượng này.
- Chọn lọc kích thước protein cần phân tích: SDS-PAGE cho phép chọn lọc các protein có kích thước cần phân tích. Có thể cắt gel SDS-PAGE ở kích thước nhất định và phân tích LC-MS. Điều này giúp tiết kiệm thời gian và tăng độ nhạy.
SDS-PAGE và LC-MS bổ trợ lẫn nhau giúp kết quả phân tích ổn định hơn. Tuy nhiên, vẫn có một số hạn chế nhất định khi kết hợp 2 kĩ thuật này. Các thành phần, hoá chất sử dụng trong SDS-PAGE đa số đã thay đổi cấu trúc của protein, điều này làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích LC-MS, đặc biệt là các mẫu protein có cấu trúc phức tạp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Smith B J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology, 1984, 1(4):41-55. https://doi.org/10.1385/0-89603-062-8:41
2. Duffy M F, Noormohammadi A H, Baseggio N, et al. Polyacrylamide gel-electrophoresis separation of whole-cell proteins. Methods in Molecular Biology, 1998, 104:267. https://doi.org/10.1385/0-89603-525-5:267
3. Manns, Joanne M. “SDS‐polyacrylamide gel electrophoresis (SDS‐PAGE) of proteins.” Current protocols in microbiology 22.1 (2011): A-3M. https://doi.org/10.1002/9780471729259.mca03ms22
4. Singh, N., K. Shepherd, and G. Cornish. “A simplified SDS-PAGE procedure for separating.” J. Cereal Sci 14 (1991): 203-208. https://doi.org/10.1016/S0733-5210(09)80039-8
5. Alba, F. Javier, et al. “Fluorescent labeling of proteins and its application to SDS-PAGE and western blotting.” Protein Blotting and Detection: Methods and Protocols. Totowa, NJ: Humana Press, 2009. 407-416. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2718-0_6
6. Gevaert, Kris, et al. “Stable isotopic labeling in proteomics.” Proteomics 8.23‐24 (2008): 4873-4885. https://doi.org/10.1002/pmic.200800421
7. Grebe, Stefan KG, and Ravinder J. Singh. “LC-MS/MS in the clinical laboratory–where to from here?.” The Clinical biochemist reviews 32.1 (2011): 5.
7. Zhou, Wanlong, Shuang Yang, and Perry G. Wang. “Matrix effects and application of matrix effect factor.” Bioanalysis 9.23 (2017): 1839-1844. https://doi.org/10.4155/bio-2017-0214
- Các phương pháp phân tích định lượng, định tính
Các phương pháp phân tích định lượng, định tính Giá trên đã bao gồm thuế phí. - Các phương pháp phân tích Sinh Hóa Lý
- Tổng quan về ELISA
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) là kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng enzyme để phát hiện và định lượng kháng nguyên hoặc kháng thể. Có […] - Các phương pháp chiết tách protein trong nghiên cứu proteomics và ứng dụng
Các tiến bộ trong công nghệ proteomics không thể khắc phục được các vấn đề trong chuẩn bị mẫu. Các bước như đồng nhất hóa mô, […] - Sự hình thành cầu disulfide trong protein
Tầm quan trọng của cầu nối Disulfide Ổn định cấu trúc Protein: Cầu nối disulfide giúp ổn định cấu trúc bậc ba và bậc bốn của […] - TỔNG QUAN WESTERN BLOTTING
Western Blotting (WB) là kĩ thuật phân tích protein được sử dụng rộng rãi trong ngành sinh hoá, sinh học phân tử. Là một kĩ thuật […] - Palmitoyl và khử palmitoyl: Vai trò trong sinh học tế bào và ung thư
Palmitoyl hóa là quá trình gắn nhóm palmitate vào protein, giúp điều chỉnh vị trí và chức năng của chúng. Quá trình này có thể đảo […] - Phân tích trình tự kháng thể: Khám phá sự đa dạng và ứng dụng
Cấu trúc kháng thể Kháng thể, còn được gọi là immunoglobulin, là một cấu trúc hình chữ Y bao gồm bốn chuỗi polypeptide – hai chuỗi […] - Giải trình tự peptide: Công cụ cốt lõi trong nghiên cứu Proteomics
Giải trình tự peptide là quá trình xác định trình tự các axit amin trong một chuỗi peptide. Đây là kỹ thuật then chốt trong proteomics, […] - Phân tích axit amin trong dinh dưỡng và công nghiệp thực phẩm
Axit amin đóng vai trò then chốt trong việc làm sáng tỏ mối quan hệ phức tạp giữa dinh dưỡng và ngành công nghiệp thực phẩm. […] - Phân tích axit amin trong kiểm soát chất lượng protein tái tổ hợp
Dược phẩm sinh học protein tái tổ hợp Rối loạn chức năng của các protein có trình tự axit amin bất thường hoặc không có […] - TỔNG QUAN VỀ SDS-PAGE
SDS-PAGE là gì? Điện di trên gel polyacrylamide biến tính với sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) là một kỹ thuật điện di protein phổ biến trong sinh […] - LIPID HÓA PROTEIN: CƠ CHẾ, PHÁT HIỆN VÀ CÁC BỆNH LÝ LIÊN QUAN
Protein lipid hóa là gì? Biến đổi sau dịch mã (PTMs) là những thay đổi hóa học xảy ra sau quá trình tổng hợp protein, liên […] - Lipid: Nhóm Phân Tử Đa Năng Trong Sinh Học và Công Nghệ
Lipid là một nhóm lớn các phân tử hữu cơ không phân cực, đặc trưng bởi tính kỵ nước (hydrophobic) và khả năng hòa tan trong […] - Glycosyl hóa: Biến đổi sau dịch mã và tác động lên cấu trúc chức năng protein
Con đường đường phân glycosyl hóa (Glycosylation pathway) là một quá trình biến đổi sau dịch mã (PTM) quan trọng, trong đó các gốc glycan được […] - Cách mạng hóa Proteomics: Tiến bộ trong công nghệ, tích hợp AI và ứng dụng rộng hơn
1. Sự phát triển của công nghệ Proteomics 1.1 Proteomics dựa trên khối phổ Proteomics dựa trên khối phổ là một lĩnh vực năng động và then […] - Phản ứng phân hủy Edman
Phản ứng phân hủy Edman là phương pháp giải trình tự protein được Pehr Edman công bố vào năm 1950. Phương pháp này giúp xác định […]
