Tổng quan về ELISA

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) là kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng enzyme để phát hiện và định lượng kháng nguyên hoặc kháng thể. Có hai cách chính được dùng trong ELISA:

1. Định lượng kháng nguyên: kháng thể được cố định trên pha rắn, sau đó thêm kháng nguyên mục tiêu và kháng thể liên hợp enzyme để tạo phức “sandwich”. Tín hiệu tạo ra tỉ lệ thuận với lượng kháng nguyên.
2. Định lượng kháng thể: cố định kháng nguyên lên bề mặt rắn, sau đó thêm mẫu chứa kháng thể và kháng thể thứ cấp gắn enzyme.

ELISA còn được ứng dụng rộng rãi không chỉ để phát hiện kháng thể virus mà còn trong các xét nghiệm nhanh tại nhà nhờ khả năng hiển thị màu sắc rõ ràng có thể quan sát bằng mắt thường.

♦ Lịch sử phát triển của ELISA

Hình 1. Lịch sử phát triển của ELISA

(Lộc, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)

♦ Phương pháp ELISA hoạt động như thế nào?

Trong phương pháp ELISA, kháng nguyên được gắn lên pha rắn. Các ống nghiệm hoặc microplate làm từ polystyrene, polyvinyl hoặc polypropylene thường được sử dụng làm pha rắn, với yêu cầu có khả năng hấp phụ tốt kháng nguyên và kháng thể, nhưng hạn chế hấp phụ các thành phần khác của phản ứng. Các microplate phổ biến nhất là loại đĩa 96 giếng.

Tùy theo loại ELISA, xét nghiệm có thể cần một hoặc nhiều thành phần như: kháng thể phát hiện sơ cấp và/hoặc thứ cấp, kháng nguyên hoặc analyte, kháng thể hoặc kháng nguyên phủ, dung dịch đệm, các bước rửa và chất nền/chromogen.

• Kháng thể phát hiện sơ cấp là kháng thể đặc hiệu, chỉ gắn kết với protein mục tiêu.
• Kháng thể phát hiện thứ cấp là kháng thể liên hợp enzyme, có khả năng nhận diện và gắn kết với kháng thể sơ cấp nhưng bản thân không có hoạt tính enzyme.

Một số enzyme thường được sử dụng trong ELISA gồm:

• Beta-galactosidase
• Glucose oxidase
• Peroxidase
• Alkaline phosphatase (phosphatase kiềm)

Trong đó, alkaline phosphatase có thể được bảo quản ở 4°C cùng với sodium azide để ổn định hoạt tính. Cặp chất nền phổ biến cho alkaline phosphatase là p-nitrophenyl phosphate, thường được bào chế dưới dạng viên; khi phản ứng dương tính, sản phẩm tạo thành có màu vàng.
Nếu sử dụng peroxidase làm enzyme, các chất nền như 5-amino salicylic acid hoặc orthophenylenediamine sẽ tạo màu nâu đặc trưng khi phản ứng xảy ra.
Với beta-galactosidase, việc đọc kết quả yêu cầu sử dụng máy đo huỳnh quang (fluorometer).

Tốc độ và độ đặc hiệu của phản ứng miễn dịch được khuếch đại nhờ hoạt động xúc tác của enzyme trên cơ chất. Thời gian phản ứng thường từ 30–60 phút. Sau đó, phản ứng có thể được dừng lại bằng cách thêm các dung dịch như NaOH, HCl hoặc H₂SO₄.

Kết quả được đo bằng máy quang phổ (spectrophotometer) trong khoảng bước sóng 400–600 nm, tùy thuộc vào enzyme liên hợp được sử dụng. Trong quy trình ELISA tiêu chuẩn, một loạt mẫu pha loãng nồng độ khác nhau sẽ được cho vào các giếng. Sau khi đo độ hấp thụ, một đường chuẩn được vẽ, trong đó nồng độ mẫu nằm trên trục hoành theo thang logarit, còn độ hấp thụ đặt trên trục tung theo thang tuyến tính.

Một xét nghiệm ELISA thông thường trải qua bốn bước chính:

Bước 1. Phủ (gắn kháng nguyên hoặc kháng thể lên pha rắn)

Bước 2. Chặn (bằng các dung dịch như albumin huyết thanh bò – BSA – nhằm ngăn chặn sự hấp phụ không đặc hiệu)

Bước 3. Phát hiện (thêm kháng thể phát hiện và enzyme liên hợp)

Bước 4. Đọc kết quả cuối cùng (sau khi phát triển màu với chất nền)

Giữa các bước, đĩa microplate cần được rửa kỹ bằng dung dịch đệm như phosphate-buffered saline (PBS) pha với chất tẩy rửa không ion, nhằm loại bỏ các thành phần chưa gắn kết. Mỗi bước rửa thường thực hiện ít nhất hai lần, tùy theo yêu cầu của quy trình cụ thể.

♦ Các loại ELISA

Các phương pháp miễn dịch enzyme (EIA) được chia làm 2 nhóm chính:

1. Phương pháp EIA đồng thể (Homogeneous enzymatic immunoassay)

• Enzyme bị vô hiệu hóa khi liên kết với kháng thể.
• Không cần bước rửa tách kháng nguyên khỏi môi trường.
• Phù hợp với việc đo các chất có nồng độ thấp như thuốc điều trị.

2. Phương pháp EIA dị thể (Heterogeneous enzymatic immunoassay)

• Phổ biến hơn và có độ nhạy cao hơn so với phương pháp đồng thể.
• Sau khi kháng nguyên liên kết với kháng thể, phức hợp kháng nguyên – kháng thể được giữ lại trên thành ống hoặc đĩa.
• Các thành phần không liên kết được loại bỏ qua quá trình rửa.
• ELISA là một kỹ thuật miễn dịch enzyme dị thể, dùng để phát hiện kháng thể đặc hiệu hoặc kháng nguyên hòa tan.
• Do cấu trúc và tính chất của các chất cần đo không đồng nhất, nên đã phát triển nhiều biến thể của ELISA để nâng cao độ đặc hiệu.

Phương pháp ELISA dị thể bao gồm các loại sau:

ELISA Trực Tiếp (Direct ELISA)

1. Cố định kháng nguyên:

• Dung dịch chứa chất phân tích được thêm vào đĩa 96 giếng, nơi kháng nguyên sẽ bám vào bề mặt nhựa. Quá trình này diễn ra trong một khoảng thời gian nhất định.
• Dung dịch đệm carbonate-bicarbonate (natri carbonate, natri bicarbonate và nước cất) được sử dụng để giúp hấp phụ kháng nguyên lên đĩa.
• Đệm được duy trì ở pH khoảng 9 để giữ cho kháng nguyên hòa tan và có điện tích âm, giúp kháng nguyên bám vào bề mặt đĩa tích điện dương.

2. Thêm các mẫu kiểm soát:

• Mẫu chuẩn, mẫu dương tính và mẫu âm tính được thêm vào đĩa để kiểm tra sự chính xác và độ tin cậy của kết quả.
• Mẫu chuẩn chứa nồng độ chất phân tích đã biết để tạo đường chuẩn.

3. Thêm kháng thể thứ cấp:

• Một kháng thể sơ cấp có gắn enzyme được thêm vào, sẽ liên kết với kháng nguyên đã bám lên đĩa.
• Đĩa được ủ trong một thời gian cho phép kháng nguyên và kháng thể liên kết.

4. Phát hiện:

• Một chất nền cho enzyme được thêm vào. Phản ứng giữa enzyme và chất nền tạo ra màu có thể được phát hiện bằng máy đọc microplate.
• Đọc kết quả so với đường chuẩn để phân tích.
• Phù hợp với xét nghiệm nhanh khi kháng nguyên có nồng độ cao.

Hình 2. ELISA Trực Tiếp (Direct ELISA)

(Lộc, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)

ELISA Gián Tiếp (Indirect ELISA)

1. Cố định kháng nguyên:

• Tương tự như ELISA trực tiếp, kháng nguyên được cố định lên bề mặt đĩa 96 giếng.
• Các bước chặn và rửa được thực hiện để giảm liên kết không đặc hiệu.

2. Thêm kháng thể sơ cấp:

• Kháng thể sơ cấp (có thể từ một loài khác) được thêm vào, liên kết với kháng nguyên đã được cố định trên đĩa.

3. Thêm kháng thể thứ cấp:

• Kháng thể thứ cấp, có gắn enzyme, được thêm vào và liên kết với kháng thể sơ cấp.
• Các bước ủ và rửa được thực hiện để loại bỏ các kháng thể dư thừa.

4. Phát hiện:

• Một chất nền cho enzyme được thêm vào, tạo ra màu sắc có thể phát hiện bằng máy đọc microplate.
• Kết quả có thể được đo dưới tia cực tím nếu kháng thể thứ cấp có gắn chất phát huỳnh quang (FLISA).
• Phù hợp với các xét nghiệm yêu cầu độ nhạy cao, như HIV.

Hình 3. ELISA Gián Tiếp (Indirect ELISA)

(Lộc, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)

Sandwich ELISA

1. Cố định kháng thể bắt giữ

• Đĩa microplate được phủ kháng thể bắt giữ đặc hiệu, ủ để bám lên bề mặt nhựa.
• Dùng dung dịch đệm chặn để bịt các vị trí trống, ngăn bám dính không đặc hiệu trong các bước sau.

2. Thêm mẫu chứa kháng nguyên

• Mẫu thử (có thể chưa tinh sạch) được thêm vào, kháng nguyên sẽ gắn với kháng thể bắt giữ.
• Ủ trong thời gian thích hợp để đảm bảo gắn kết ổn định, sau đó rửa để loại bỏ thành phần dư.

3. Thêm kháng thể phát hiện và kháng thể thứ cấp

• Thêm kháng thể phát hiện nhận diện epitope khác trên kháng nguyên → hình thành cấu trúc sandwich.
• Sau đó, thêm kháng thể thứ cấp liên hợp enzyme (nếu cần), giúp tạo tín hiệu ở bước cuối.

4. Thêm chất nền và đọc kết quả

• Dung dịch chất nền được thêm vào để phản ứng với enzyme → tạo sản phẩm màu.
• Dùng máy đọc microplate để đo cường độ màu, tín hiệu tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên trong mẫu.
• Sandwich ELISA thường được sử dụng trong các xét nghiệm tại chỗ, chẳng hạn như trong các bộ thử thai tại nhà

Hình 4. Sandwich ELISA

(Lộc, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)

Competitive ELISA (Elisa cạnh tranh)

1. Tạo phức hợp kháng thể – kháng nguyên

• Mẫu chứa kháng nguyên được trộn với kháng thể sơ cấp để hình thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể.
• Càng nhiều kháng nguyên trong mẫu thì càng nhiều kháng thể bị chiếm giữ, ít kháng thể tự do.

2. Thêm vào giếng đã phủ sẵn kháng nguyên

• Hỗn hợp trên được cho vào giếng đã phủ kháng nguyên tinh khiết → kháng thể còn rảnh sẽ gắn lên giếng.
• Có sự cạnh tranh giữa kháng nguyên trong mẫu và kháng nguyên trên giếng để gắn với kháng thể.

3. Thêm kháng thể thứ cấp gắn enzyme

• Kháng thể thứ cấp gắn enzyme sẽ gắn với kháng thể sơ cấp bám trên giếng.
• Lượng enzyme gắn càng nhiều nếu có ít kháng nguyên trong mẫu, và ngược lại.

4. Thêm chất nền và đọc kết quả

• Thêm chất nền để enzyme tạo sản phẩm màu, sau đó đọc kết quả bằng máy đo ELISA.
• Tín hiệu tỷ lệ nghịch với lượng kháng nguyên trong mẫu: kháng nguyên càng nhiều, màu càng nhạt.
• Competitive ELISA có thể được sử dụng để phát hiện mức độ kháng thể chống thuốc trong huyết thanh của bệnh nhân đang được điều trị bằng thuốc chống yếu tố hoại tử khối u (TNF) cho bệnh viêm khớp dạng thấp và bệnh viêm ruột.

Hình 5. Competitive ELISA (Elisa cạnh tranh)

(Lộc, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)

Bảng 1. Ưu và nhược điểm của các loại Elisa

(Lộc, Research Intern, Hoan Vu Biomolecules., JSC)

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

[1] Aydin, S. (2015). A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72, 4–15. doi:10.1016/j.peptides.2015.04.012 

[2] Alhajj, M., Zubair, M., & Farhana, A. (2023). Enzyme Linked Immunosorbent Assay. In StatPearls. StatPearls Publishing.

[3] Shah, K., & Maghsoudlou, P. (2016). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine, 77(7), C98–C101. doi:10.12968/hmed.2016.77.7.c98 

BÀI VIẾT MỚI >>

• 
  Các phương pháp phân tích định lượng, định tính15/01/2026
  Các phương pháp phân tích định lượng, định tính Giá trên đã bao gồm thuế phí.
• 
  Các phương pháp phân tích Sinh Hóa Lý15/01/2026
• 
  Tổng quan về ELISA05/05/2025
  ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) là kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng enzyme để phát hiện và định lượng kháng nguyên hoặc kháng thể. Có […]
• 
  Các phương pháp chiết tách protein trong nghiên cứu proteomics và ứng dụng10/04/2025
  Các tiến bộ trong công nghệ proteomics không thể khắc phục được các vấn đề trong chuẩn bị mẫu. Các bước như đồng nhất hóa mô, […]
• 
  Sự hình thành cầu disulfide trong protein10/04/2025
  Tầm quan trọng của cầu nối Disulfide Ổn định cấu trúc Protein: Cầu nối disulfide giúp ổn định cấu trúc bậc ba và bậc bốn của […]
• 
  TỔNG QUAN WESTERN BLOTTING28/03/2025
  Western Blotting (WB) là kĩ thuật phân tích protein được sử dụng rộng rãi trong ngành sinh hoá, sinh học phân tử. Là một kĩ thuật […]
• 
  Palmitoyl và khử palmitoyl: Vai trò trong sinh học tế bào và ung thư24/03/2025
  Palmitoyl hóa là quá trình gắn nhóm palmitate vào protein, giúp điều chỉnh vị trí và chức năng của chúng. Quá trình này có thể đảo […]
• 
  Phân tích trình tự kháng thể: Khám phá sự đa dạng và ứng dụng24/03/2025
  Cấu trúc kháng thể Kháng thể, còn được gọi là immunoglobulin, là một cấu trúc hình chữ Y bao gồm bốn chuỗi polypeptide – hai chuỗi […]
• 
  Giải trình tự peptide: Công cụ cốt lõi trong nghiên cứu Proteomics21/03/2025
  Giải trình tự peptide là quá trình xác định trình tự các axit amin trong một chuỗi peptide. Đây là kỹ thuật then chốt trong proteomics, […]
• 
  Phân tích axit amin trong dinh dưỡng và công nghiệp thực phẩm21/03/2025
  Axit amin đóng vai trò then chốt trong việc làm sáng tỏ mối quan hệ phức tạp giữa dinh dưỡng và ngành công nghiệp thực phẩm. […]
• 
  Phân tích axit amin trong kiểm soát chất lượng protein tái tổ hợp21/03/2025
    Dược phẩm sinh học protein tái tổ hợp Rối loạn chức năng của các protein có trình tự axit amin bất thường hoặc không có […]
• 
  TỔNG QUAN VỀ SDS-PAGE14/03/2025
  SDS-PAGE là gì? Điện di trên gel polyacrylamide biến tính với sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) là một kỹ thuật điện di protein phổ biến trong sinh […]
• 
  LIPID HÓA PROTEIN: CƠ CHẾ, PHÁT HIỆN VÀ CÁC BỆNH LÝ LIÊN QUAN14/03/2025
  Protein lipid hóa là gì? Biến đổi sau dịch mã (PTMs) là những thay đổi hóa học xảy ra sau quá trình tổng hợp protein, liên […]
• 
  Lipid: Nhóm Phân Tử Đa Năng Trong Sinh Học và Công Nghệ11/03/2025
  Lipid là một nhóm lớn các phân tử hữu cơ không phân cực, đặc trưng bởi tính kỵ nước (hydrophobic) và khả năng hòa tan trong […]
• 
  Glycosyl hóa: Biến đổi sau dịch mã và tác động lên cấu trúc chức năng protein11/03/2025
  Con đường đường phân glycosyl hóa (Glycosylation pathway) là một quá trình biến đổi sau dịch mã (PTM) quan trọng, trong đó các gốc glycan được […]
• 
  Cách mạng hóa Proteomics: Tiến bộ trong công nghệ, tích hợp AI và ứng dụng rộng hơn11/03/2025
  1. Sự phát triển của công nghệ Proteomics 1.1 Proteomics dựa trên khối phổ Proteomics dựa trên khối phổ là một lĩnh vực năng động và then […]
• 
  Phản ứng phân hủy Edman10/03/2025
  Phản ứng phân hủy Edman là phương pháp giải trình tự protein được Pehr Edman công bố vào năm 1950. Phương pháp này giúp xác định […]
• 
  Applications of Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) in Protein Analysis for Biomedical Research05/03/2025
  Applications of Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) in Protein Analysis for Biomedical Research 1. Giới thiệu Proteomics – nghiên cứu toàn bộ bộ protein của một hệ […]
• 
  Kỹ thuật định lượng không nhãn05/03/2025
  Kỹ thuật định lượng không nhãn là gì? Ngày nay, các nghiên cứu về proteomics không còn chỉ tập trung vào việc xác định càng nhiều […]
• 
  Matrix effects and application of matrixeffect factor03/03/2025
  Matrix effects and application of matrix effect factor 1. Thực trạng Hiện nay, LC-MS là một trong những kĩ thuật phân tích tối ưu nhất về […]